Ich möchte meinen Mitarbeitern bei MilliporeSigma, Philip J. Morrissey und Sherree L. Friend, für ihre Unterstützung und Führung im Laufe der Jahre danken. Ich möchte auch Vidya Venkatachalam und Bryan R. Davidson für ihre Hilfe bei der BDC3-Funktion in der IDEAS-Software , Ryan P. Jessup für die Bearbeitung dieses Manuskripts, Raymond Kong für Hilfe am Tag des Schießens und ein besonderes Dankeschön danken Zum Maskenbildner Cynthia Xamonthiene.

<ol>
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Ich bin bei MilliporeSigma beschäftigt, dem Hersteller der Amnis-Marke ImageStream, die in dieser Studie verwendet wurde.

Bei der Durchführung dieser Analyse gibt es ein paar Dinge zu beachten. Es ist wichtig, entsprechende Kontrollproben zu haben. Für dieses Experiment wurden zwei verschiedene Kontrollen verwendet: Kontrolle und Kontrolle + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Schwelle für die Regionen festzulegen. Es stellt die Grundstufe der Autophagie dar, ohne den lysosomalen Abbau zu stoppen und ist die Kontrolle für die verstorbene Probe. Allerdings ist die Kontrollprobe keine geeignete Kontrolle, um mit den Ergebnissen der Starved + Chloroquine Probe zu vergleichen, da Chloroquin selbst die Kontrollprobe beeinflusst. Daher war es notwendig, eine Kontrolle + Chloroquin Probe zu haben. Vor der Durchführung einer Analyse für Autophagie, ist es wichtig, nur analysieren / Gate auf einzelne Zellen, die im Fokus sind ( dh Gradient RMS größer als 60), da die Ergebnisse betroffen sein könnten, wenn es mehr als eine Zelle oder die Bilder sind unscharf. Es ist entscheidend, dass das AutophagosomEs und Lysosomen sind im Fokus für die richtige Punktzählung und BDC3-Analyse. Apoptotische Zellen müssen vor der Autophagie-Analyse entfernt werden, da sie Ergebnisse schneiden können und nicht aufgenommen werden sollten. Es sollte eine angemessene Färbung für alle drei Marker ( dh LC3, p62 und LAMP1) geben. Zum Beispiel sind alle drei Marker intrazellulär und sollten ein punktuelles Signal haben; Wenn das Signal nicht punktiert ist oder ob es sich auf der Oberfläche der Zelle befindet, wäre die Färbung nicht angemessen und das Experiment / Färben sollte erneuert werden. Darüber hinaus, für BDC3 genau zu sein, ist es wichtig, auf Zellen, die hell sind für alle drei fluoreszierenden Marker von Interesse. Gating auf positive Ereignisse ist erforderlich, um die Messung von BDC3 auf unspezifische Bindung, Bildgebung Artefakte und / oder Rauschen zu verhindern. Dies ist entscheidend, da BDC3 potenziell Artefakte verstärken kann, die keine wahren Signale sind. Da BDC3 nur bei hellen positiven Ereignissen durchgeführt werden kann, können viele Zellen nicht in die endgültige Analyse einbezogen werden; Das ist especEcht für Kontrollzellen, die keine Akkumulation von LC3, p62 und / oder LAMP1 haben. Eine Einschränkung dieses Assays besteht also darin, dass BDC3 nur Zellen untersucht, die für alle drei Marker positiv sind, die für alle Autophagieexperimente nicht geeignet sind. Wie BDS, die bereits gemeldet wurde, 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 allein, berücksichtigt nicht die Anzahl der autophagischen Organellen, die sich lokalisieren, was zu einem großen Teil führt Der Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen. Daher ist der bivariate Ansatz von Rajan et al. war angestellt. Wenn man die bivariate Plots betrachtet, könnte man fragen, obDie Zellen müssen positiv für LC3, p62 und LAMP1 sein; Warum gibt es so viele Zellen, die 0 Spots haben? Dies liegt daran, dass das LC3-Signal für die Co-Lokalisierung hell genug sein könnte, aber es könnte nicht die von der Peak-Maske eingestellte Schwelle (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) erfüllen, die für die Verwendung als a erforderlich ist Stelle. Das hier vorgestellte Protokoll verwendete MIFC, um LC3 puncta zu zählen und die Co-Lokalisierung von drei Autophagie-Markern zur Messung des autophagischen Flusses. Unter basalen Bedingungen (Kontrollprobe) war die Anzahl der Autophagosomen niedrig, und wenige Zellen wurden mit &quot;High Spots&quot; gefunden. Mit der Zugabe von Chloroquin, das die Autophagosom / Lysosomen-Fusion hemmt, kam es zu einer Erhöhung der Anzahl der LC3-Spots. Da das Lysosom nicht in der Lage ist, das Autophagosom zu brechen und das p62, das im Autophagosom liegt, führt dies zu einer Erhöhung der Co-Lokalisation der LC3-, p62- und LAMP1-Autolysosomen-Akkumulation. Dieser Effekt wurde unter Nährstoff-Starvat verstärktIonen, die Autophagie induziert. Allerdings, ohne die Zugabe von Chloroquin, gab es keine signifikante Erhöhung der Anzahl der Autophagosomen, wahrscheinlich aufgrund einer Erhöhung der Rate der autophagischen Umsatz. Als die Zellen in Gegenwart von Chloroquin verhungert wurden, gab es eine Zunahme der Co-Lokalisierung und Anzahl der Autophagosomen, die die Schlussfolgerung unterstützt, dass der Hunger den autophagischen Fluss erhöht. EBSS ist bekannt als ein leistungsfähiger Induktor der Autophagie. Daher ist zu erwarten, dass die Zunahme groß wäre. Wenn ein anderes Verfahren, wie z. B. Arzneimittelinduktion, verwendet wird, um Autophagie zu induzieren, kann der Unterschied zwischen der Kontrolle und den behandelten Proben subtiler sein. Dieses spezielle Protokoll wurde entwickelt, um Autophagie in menschlichen Zelllinien zu messen, aber der Assay könnte an andere Spezies angepasst werden, indem er auf Antikörper für diese spezielle Spezies umschaltet. Darüber hinaus könnte die Analyse-Methode für jede intrazelluläre Anwendung, die die Co-Lokalisierung erfordert verwendet werdenVon drei Sonden / Markern.

Makroautophagie, im Folgenden Autophagie genannt, ist ein katabolischer Weg, in dem beschädigte oder dysfunktionelle Komponenten, langlebige Proteine ​​und Organellen über das Lysosom abgebaut und recycelt werden 1 . Autophagie ist ein dynamischer, mehrstufiger Prozess, der die Bildung eines Autophagosoms beinhaltet; Die Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom, die das Autolysosom bildet; Und der Abbau des Inhalts des Autolysosoms 2 . Der entscheidende biologische Marker, der zur Identifizierung von Autophagie in Säugetiersystemen verwendet wird, ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), das die autophagosomale Membran bildet. Während der Autophagie wird zytosolisches LC3-1 an Phosphatidylethanolamin konjugiert, um LC3-II zu bilden; LC3-II wird dann in die autophagosomale Membran 3 eingearbeitet. Ein weiterer weit verbreiteter Marker für autophagischen Fluss ist das Autophagie-Rezeptor-Sequestosom 1 (SQSTM1, p62), das physisch liNaut autophagische Ladung an die autophagische Membran 4 , 5 . Methoden, die traditionell verwendet wurden, um Autophagie zu messen, sind Western Blots und Fluoreszenzmikroskopie 7 . Jedoch werden keine dieser Methoden als der &quot;Goldstandard&quot; betrachtet 2 , 6, da es Herausforderungen gibt, die mit diesen beiden Techniken verbunden sind. Western Blots geben nur einen Durchschnitt, weil sie eine homogenate Probe verwenden, so dass Beobachter nicht sehen können, was in einzelnen Zellen passiert. Auf der anderen Seite gibt die Fluoreszenzmikroskopie eine Beobachterinformation auf der einzelligen Ebene, aber es fehlt die Durchsatzfähigkeit, so dass es schwierig ist, objektive und statistisch rigorose Einschätzungen zu erhalten. In den letzten Jahren hat die Messung von LC3 und p62 durch multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie (MIFC, siehe Tabelle der Materialien ) popu gewonnenGröße durch seine quantitative Leistung, hohe Durchsatzfähigkeiten, Multiplex-Potential und die Fähigkeit, jede Zelle abzubilden. Eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Messung der Autophagie mit MIFC, zusammen mit ihrer Begleitanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien ), ist durch die Punktzählung von LC3 puncta oder autophagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Allerdings bedeutet eine Erhöhung der Autophagosomen nicht zwangsläufig, dass es eine Erhöhung der Autophagie gibt, da sie auch eine Blockade im Prozess darstellen könnte 2 . LC3-II Umsatz ist ein nützlicher Parameter, um autophagischen Fluss zu messen durch die Analyse von Zellen in der Gegenwart undAbwesenheit eines lysosomalen Abbauinhibitors, wie Chloroquin. Chloroquin inhibiert die Fusion des Autophagosom zum Lysosom, wodurch die Quantifizierung der Autophagosom Bildung als Maß für den Grad der durch autophagy autophagischen Flußmittel vor dem lysosomalen Abbau Arretieren kann 18 auftreten. Darüber hinaus wird p62 primär durch Autophagie abgebaut, und wenn der lysosomale Abbau des Autophagosoms und seines Inhalts blockiert wird, wird eine Anreicherung von p62 erwartet, 17 , 19 . Autophagy ist ein mehrstufiger Prozess, und die Messung von LC3 oder p62 allein liefert kein vollständiges Bild dessen, was in den Zellen passiert. Die jüngsten Veröffentlichungen haben die Notwendigkeit betont, die gleichzeitige Bildung des Autolysosoms 2 , 17 , 20 , 21 zu untersuchen . MIFC istDie die Bildung des Autolysosoms durch die Abbildung der Co-Lokalisierung des Autophagosoms an das Lysosom 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 eindeutig messen kann. Darüber hinaus wurde auch die Co-Lokalisierung von p62 und LC3 unter Verwendung von MIFC untersucht, um den autophagischen Fluss 5 zu messen. In der referenzierten Analysesoftware heißt das &quot;Merkmal&quot;, das die Co-Lokalisierung misst, &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) und wurde speziell entworfen, um die kleinen, hellen Bilddetails von zwei Bildern zu vergleichen. BDS ist der logarithmierte Pearson-Korrelationskoeffizient der lokalisierten hellen Flecken mit einem Radius von 3 Pixeln oder weniger; Mit anderen Worten, BDS berechnet den Grad von oVerkürzte Pixel aus zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen. Die hellen Flecken sind entweder korreliert ( dh gleiche räumliche Lage) oder unkorrelierte ( dh unterschiedliche räumliche Orte). Daher variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Bereich zwischen null und unendlich 26 , 27 zu erhöhen. BDS allein darf nicht ausreichen; Rajan et al. Dass mit nur BDS zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen könnte 21 . BDS bewertet die Co-Lokalisierung von zwei Marker der Autophagie, aber nicht die Anzahl der Autophagosomen. Um die Anzahl der Autophagosomen zu berücksichtigen, haben Rajan et al. Inklusive Punktzählung der LC3 puncta 21 . Rajan et al. Vorgeschlagen, mit einem bivariate Scatter-Plot von LC3-Spot-Zählung gegenüber BDS. Mit dieser bivariate Handlung, zwei Populationen werE zuerst identifiziert: eine mit Zellen, die ein hohes Maß an LC3 Spots und eine mit Zellen, die ein niedriges Niveau von LC3 Spots haben. Die Hoch-LC3-Punkt-Population wurde weiter in zwei Populationen unterteilt: Zellen mit geringer Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autophagosomen) und Zellen mit hoher Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autolysosomen). Diese bivariate Handlung erlaubt es, zwischen Zellen mit sehr wenigen Autophagosomen und Zellen mit einer Anhäufung von Autophagosomen und / oder Autolysosomen zu unterscheiden 21 . Bisher war die gleichzeitige Ko-Lokalisierung von LC3, p62 und LAMP1 (lysosomaler Marker) nicht möglich mit einem einzigen &quot;Feature Type&quot; in der MIFC Companion Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Ein neues Feature, das kürzlich in Version 6.1 eingeführt wurde, heißt Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergleicht die hellen Detailbilder von jedem der drei Bilder (in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1) und quantifiziert die Co-Lokalisierung der drei Sonden ( dh LC3, p62 und LAMP1). Die BDC3-Funktion berechnet den Korrekturkoeffizienten des Pearson, der modifiziert wurde, um auf drei Bilder zu erweitern. Da die hellen Flecken in den drei Bildern entweder korreliert oder unkorreliert sind, variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Dynamikbereich zwischen 0 und unendlich zu erhöhen. Durch das Ausschalten der BDS-Funktion mit der BDC3-Funktion, die Analyse-Methode von Rajan et al. Kann nun die drei am häufigsten verwendeten Marker zur Messung der Autophagie in einem System zur gleichen Zeit einbinden. Die Fähigkeit, diese drei Marker von Autophagie in einem einzigen Assay zu lokalisieren, könnte zu neuartigen Einsichten in die Induktion und Regulierung der Autophagie führen. Das folgende Protokoll skizziert die Schritte, um Autophagie in Jurkat-Zellen zu induzieren; Markieren Sie die Zellen mit LC3-, p62- und LAMP1-Antikörpern; Erwerben von Daten auf einem MultispEctral Bildgebungsdurchflusszytometer; Und analysieren die Daten, um autophagischen Fluss zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagie ist ein katabolischer Weg, in dem normale oder dysfunktionelle zelluläre Komponenten, die sich während des Wachstums und der Differenzierung ansammeln, über das Lysosom abgebaut und recycelt werden. Während der Autophagie wird das zytoplasmatische LC3-Protein lipidiert und an die autophagosomalen Membranen rekrutiert. Das Autophagosom verschmilzt dann mit dem Lysosom, um das Autolysosom zu bilden, wo der Abbau der Autophagosomen-Vesikel und deren Inhalt auftritt. Das ubiquitin-assoziierte Protein p62, das an LC3 bindet, wird auch zur Überwachung des autophagischen Flusses verwendet. Zellen, die sich einer Autophagie unterziehen, sollten die Co-Lokalisierung von p62, LC3 und lysosomalen Markern nachweisen. Immunfluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um LC3 puncta, p62 und / oder Lysosomen auf einer per-Zell-Basis visuell zu identifizieren. Eine objektive und statistisch rigorose Bewertung kann jedoch schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie zusammen mit einem analytischen Merkmal verwendet, das die helle de vergleicht(LC3, p62 und lysosomale LAMP1) und quantifiziert ihre Co-Lokalisierung in Kombination mit LC3-Punktzählung, um Autophagie in einer objektiven, quantitativen und statistisch robusten Weise zu messen.

Diese Analysemethode verwendet mehrere Merkmale, um den autophagischen Fluss zu bekämpfen. Um die endgültige bivariate Handlung vollständig zu verstehen, müssen zunächst die einzelnen Analysemerkmale untersucht werden. Das Zählen von Autophagosomen ist ein logischer Weg, um Autophagie zu messen; Allerdings kann die Größe / Form / Helligkeit von LC3 puncta drastisch zwischen den Zellen variieren. Variation kann es schwierig machen, Autophagosomen manuell zu zählen oder eine Spot-Zählfunktion in der Analysesoftware zu verwenden. Daher ist kein Punktzähler-Feature perfekt aufgrund dieser großen Variabilität in Autophagosomen. Jedoch wird ein gutes Punktzählungsmerkmal an den meisten Zellen arbeiten 26 . Abbildung 3 zeigt Beispiele für die Punktmaskierung von LC3-Puncta in Jurkat-Zellen mit verschiedenen Spotmasken. Die für diesen Datensatz ausgewählte Spot-Count-Funktion ist Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, was bedeutet, dass die Spot-Zähl-Funktion die Spots gezählt hatAk-Maske (M11) auf Kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) mit einem Punkt-zu-Zellen-Hintergrundverhältnis von 4 (Bright, 4) identifiziert. Fig. 4 zeigt Spot-Zähl-Histogramme und repräsentative Bilder für die mittlere Spotzahl für die mit Anti-LC3-AF647 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen. Die Kontrolle und die verhungerten Mittelpunkte sind nicht signifikant unterschiedlich; Bei der Zugabe von Chloroquin gibt es einen großen Unterschied im Mittel der Kontrolle + Chloroquin im Vergleich zu dem Starved + Chloroquin. Die nächste zu untersuchende Funktion ist BDC3. BDC3 ist ein Maß für die Co-Lokalisierung von drei Markern / Sonden, in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1. Abbildung 5A - 5D zeigt BDC3-Histogramme für die mit Anti-p62-AF488 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen, Anti-LAMP1-PE und Anti-LC3-AF647. Es gibt eine Verschiebung zwischen dem Kontrollmittel zum verhungerten Mittelwert, sowie die Kontrolle + Chloroquin bedeutet für das Starved + Chloroquin-Mittel. Wenn man jedoch die Bilder von Zellen aus den mittleren BDC3-Scores in Abbildung 5E- 5H betrachtet , gibt es einen größeren Unterschied zwischen den Proben, als die Histogramme einen zu glauben führen können. Dies ist, weil BDC3 nicht die Anzahl der Autophagie Organellen, die co-lokalisieren, was zu einem großen Maß an Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen für die gleiche BDC3-Score. In den meisten Fällen gibt es eine Überlappung zwischen allen drei Sonden, da auch in Basalstufen p62, LAMP1 und LC3 bis zu einem gewissen Grad in ähnlichen Bereichen in den Zellen co-lokalisieren oder sich befinden sollen. Als Kontrast kann ein Beispiel für drei Sonden, die nicht ko-lokalisieren sollten, anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 und DAPI-Kernfarbstoff für die Starved + Chloroquine-Probe, wie in Abbildung 6 gezeigt/ P&gt; Wenn das Spot-Zählmerkmal und die BDC3-Funktion kombiniert werden, ist das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen, die die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Proben / Bedingungen verbessern, offensichtlich. Abbildung 7 zeigt die bivariate Darstellung der Spotzahl von LC3 gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für die vier Proben: Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Gating-Strategie für drei Populationen festzulegen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3. Die Kontrollproben zeigten, dass mehr als 98% der Zellen 1 oder weniger Flecken hatten. Die Grenze zwischen den High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3 wurde auf einen BDC3 Score von 1 gesetzt, da mehr als 91% der Control Probe einen BDC3 Score von weniger als 1 hatten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die bivariate Plots Ist in Tabelle 1 dargestellt . Alter = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Abbildung 1: Einstellung des MIFC-Geräts. Ein Screenshot der MIFC-Instrumenteneinstellungen, die für dieses Experiment verwendet wurden, in Schritt 8 des Protokolls skizziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Abbildung 2: Analyse-Software-Gating-Strategie. Ein Screenshot der Analyse-Software-Gating-Schema, skizziert in Schritt 9 des Protokolls. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: LC3-Spot-Maskierung. Jurkat Zelle Bilder und Masken verwendet, um die Spot-Zähl-Feature zu erstellen. Gezeigt sind BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) und Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Die Maske, die am besten für alle gezeigten Zellen funktionierte, war Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Abbildung 4: LC3-Spot-Count-Histogramme. Verwenden Sie die Spot-Count-Funktion Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 und die LC3-AF647 Spot-Zähler-Histogramme für Control ( A , hellblau), Control + ChloroquinE ( B , blau), verhungert ( C , rosa) und verhungert + Chloroquin ( D , rot). Der mittlere Punkt zählt für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin sind 0,07, 1,13, 0,10 bzw. 2,77. BF, LC3-AF647 (rot), DAPI-Kernfarbstoff (blau) und ein Komposit der LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für die mittlere Punktzahl sind für die Kontrolle ( E , 0-Punkte), Control + Chloroquin ( F , 1 Stelle), Starved ( G , 0 Spots) und Starved + Chloroquine ( H , 3 Spots). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Abbildung 5: BDC3 Histogramme von p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Histogramme fürR Kontrolle ( A , hellblau), Kontrolle + Chloroquin ( B , Blau), Verhungert ( C , Rosa) und Starved + Chloroquin ( D , Rot). Die mittlere BDC3-Punktzahl für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, Starved und Starved + Chloroquin beträgt 0,57, 0,82, 0,74 bzw. 0,98. BF; P62-AF488 (grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Composite der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 sind für die Kontrolle ( E ), Control + Chloroquin ( F ), Starved ( G ) und Starved + Chloroquin ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Abbildung 6: BDC3 Histogramme von p62 / LC3 / DAPI für die Starved + Chloroquine Probe. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI-Histogramm für die Starved + Chloroquin-Probe wird gezeigt. Die mittlere BDC3-Punktzahl beträgt 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grün); LC3-AF647 (rot); DAPI (blau); Und ein Komposit der p62-AF488-, LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 ist für die Starved + Chloroquin-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Abbildung 7: Bivariate Plots von LC3 Spot Count gegen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate Plots der LC3-Spotzahl gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für Control, Control + Chloroquine, Starved und Starved + Chloroquine Jurkat-Zellen. ( B ) BF; P62-AF488 (Grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Verbund der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder aus drei Regionen ( dh Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3) sind für die Starved + Chloroquine-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Anzahl der Zellen </td><td> Helles Detail Kolokalisierung 3 Mittelwert </td><td> Spot Count LC3 Mittler </td><td> % Niedriger Punkt </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Steuern </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Kontrolle + Chloroquin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Verhungert </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> Verhungert + Chloroquin </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung der Jurkat LC3 Spotzählung gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Aufrufe.  MilliporeSigma.  Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen. 

Serie: Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Forschung

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der LC3-II-positiven EV-Freisetzung in der Autophagie mit gestörter Lysosomenfusion

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf cytoplasmic contents, subsequently fusing with lysosomes for degradation. Beyond the canonical role, autophagy-related genes also modulate a secretory pathway involving the release of inflammatory molecules, tissue repair factors, and extracellular vesicles (EVs). Notably, the process of disseminating pathological proteins between cells, particularly in neurodegenerative diseases affecting the brain and spinal cord, underscores the significance of understanding this phenomenon. Recent research suggests that the transactive response DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43), a key player in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration, is released in an autophagy-dependent manner via EVs enriched with the autophagosome marker microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), especially when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.
To elucidate the mechanism underlying the formation and release of LC3-II-positive EVs, it is imperative to establish an accessible and reproducible method for evaluating both intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. This study presents a detailed protocol for assessing LC3-II levels via immunoblotting in cellular and EV fractions obtained through differential centrifugation. Bafilomycin A1 (Baf), an inhibitor of autophagosome-lysosome fusion, serves as a positive control to enhance the levels of intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is used as a marker for multivesicular bodies. Applying this protocol, it is demonstrated that siRNA-mediated knockdown of syntaxin-6 (STX6), a genetic risk factor for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, augments LC3-II levels in the EV fraction of cells treated with Baf while showing no significant effect on TSG101 levels. These findings suggest that STX6 may negatively regulate the extracellular release of LC3-II via EVs, particularly under conditions where autophagosome-lysosome fusion is impaired. Combined with established methods for evaluating autophagy, this protocol provides valuable insights into the role of specific molecules in the formation and release of LC3-II-positive EVs.

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Here, we present the methodology for concisely assessing autophagosome marker LC3-II levels in extracellular vesicles (EVs) by immunoblotting. Analysis for LC3-II levels in EVs, autolysosome formation, and omegasome formation suggests the new role of STX6 in the release of LC3-II-positive EVs when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

Biochemie

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medizin

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Zusammenfassung

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Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis