אני רוצה להודות לעמיתים לעבודה במיליפור סיגמה, פיליפ ג &#39;מוריסי ושרי ל&#39;, על תמיכתם והדרכתם לאורך השנים. אני גם רוצה להודות Vidya Venkatachalam ו בריאן ר דוידסון על עזרתם עם תכונה BDC3 בתוכנה IDEAS , ראיין פ Jessup לעזרה בעריכת כתב היד הזה, ריימונד קונג לעזרה ביום הירי, תודה מיוחדת לך האמן סינתיה Xamonthiene.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

אני מועסק על ידי MilliporeSigma, יצרנית של ImageStream המותג Amnis, אשר שימש במחקר זה.

בעת ביצוע ניתוח זה, יש כמה דברים לשקול. חשוב שיהיה דגימות בקרה מתאימות. עבור ניסוי זה, שני בקרות שונות שימשו: שליטה ובקרה + Chloroquine. מדגם הבקרה שימש לקביעת הסף עבור האזורים. הוא מייצג את רמת הבסיס של autophagy מבלי לעצור השפלה ליזוזומלית היא שליטה על המדגם מורעב. עם זאת, מדגם בקרה אינו שליטה נאותה להשוות עם התוצאות מדגם מורעב + כלורוקווין כי chloroquine עצמה משפיעה על מדגם שליטה. לכן, היה צורך להיות מדגם + כלורוקואין בקרה. לפני ביצוע כל ניתוח עבור autophagy, חשוב לנתח רק / שער על תאים בודדים ממוקדים ( כלומר, RMS שיפוע גדול מ -60), כמו התוצאות יכול להיות מושפע אם יש יותר מתא אחד או התמונות לא ממוקד. זה חיוני כי autophagosomEs ו lysosomes ממוקדים ספירת ספוט הנכון ניתוח BDC3. תאים אפופטוטיים יש להסיר לפני ניתוח autophagy, כפי שהם עשויים להטות תוצאות ולא צריך להיכלל. לא צריך להיות מכתים המתאים לכל שלושת הסמנים ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). לדוגמה, כל שלושת הסמנים הם תאיים, ויש להם אות נקודתי; אם האות לא לדקלם, או אם הוא על פני השטח של התא, מכתים לא יהיה מתאים את הניסוי / מכתים צריך להיות משוחזר. בנוסף, עבור BDC3 להיות מדויק, זה חיוני השער על תאים בהירים עבור כל שלושה סמנים ניאון של עניין. Gating על אירועים חיוביים יש צורך למנוע את המדידה של BDC3 על שאינם ספציפיים מחייב, הדמיה artifacts, ו / או רעש. זה חיוני, כמו BDC3 יכול פוטנציאל להגביר artifacts שאינם אותות אמיתי. מאז BDC3 יכול להתבצע רק על אירועים חיוביים בהירים, תאים רבים עשויים שלא להיכלל בניתוח הסופי; זה especEly נכון לתאי בקרה שאין להם הצטברות של LC3, p62 ו / או LAMP1. לפיכך, הגבלה של assay זה הוא BDC3 רק בוחן תאים חיוביים עבור כל שלושת הסמנים, אשר עשוי שלא להיות מתאים לכל הניסויים autophagy. כמו BDS, אשר כבר דווחו בעבר 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 לבדו אינו לוקח בחשבון את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך במידה רבה של השתנות במספר האוטופגוזומים. לכן, הגישה הדו-כיוונית שהציג ראג&#39;אן ואח &#39; היה מועסק. בהסתכלות על המגרשים הדו-פעמיים, אפשר לשאול אםהתאים חייבים להיות חיוביים עבור LC3, p62 ו- LAMP1; למה יש כל כך הרבה תאים שיש להם 0 נקודות? הסיבה לכך היא כי האות LC3 עשוי להיות בהיר מספיק עבור שיתוף לוקליזציה, אבל זה לא יכול לענות על סף שנקבע על ידי מסיכת שיא (שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) זה נחוץ כדי להיחשב לְזַהוֹת. הפרוטוקול שהוצג כאן השתמשו MIFC לספור LC3 puncta ואת שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים autophagy למדוד שטף autophagic. בתנאים הבסיסיים (מדגם בקרה), מספר האוטופגוזומים היה נמוך, ומעטים נמצאו תאים עם &quot;נקודות גבוהות&quot;. עם תוספת של chloroquine, אשר מעכב היתוך אוטופאגוזום / lysosome, חלה עלייה במספר כתמים LC3. מאז lysosome אינו מסוגל לשבור את autophagosome ואת p62, אשר מתגורר autophagosome, זה מוביל לעלייה של לוקליזציה של LC3, p62, ו LAMP1 autolysosome הצטברות. השפעה זו היתה מוגברת תחת starvat מזיןיון, אשר גורם autophagy. עם זאת, ללא תוספת של chloroquine, לא היה גידול משמעותי במספר autophagosomes, ככל הנראה בשל עלייה בשיעור של autophagic מחזור. כאשר התאים רעבו בנוכחות כלורוקין, חלה עלייה בלוקליזציה המשותפת ובמספר האוטופגוזומים, התומכת במסקנה שהרעבה מגבירה את השטף האוטופאגי. EBSS ידוע כגורם חזק של autophagy. לכן, צפוי כי הגידול יהיה גדול. אם שיטה אחרת, כגון אינדוקציה של סמים, משמשת להפקת אוטופאגי, ההבדל בין הדגימה לשליטה והדגימה עשוי להיות מתוחכם יותר. פרוטוקול מסוים זה נועד למדוד autophagy שורות תאים אנושיים, אבל assay יכול להיות מותאם למינים אחרים על ידי מעבר נוגדנים עבור מינים מסוימים. בנוסף, שיטת הניתוח יכול לשמש עבור כל יישום תאיים הדורש שיתוף לוקליזציהשל שלושה בדיקות / סמנים.

Macroautophagy, המכונה להלן autophagy, הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים פגומים או מתפקדת, חלבונים ארוכי טווח, ואת האברונים מושפלים באמצעות lysosome ו ממוחזרים 1 . Autophagy הוא תהליך דינמי, רב-כיווני הכולל את היווצרותו של אוטופגוזום; את ההיתוך של האוטופגוזום עם הליזוזום, שיצר את האוטוליזוסום; ואת השפלה של התוכן של autolysosome 2 . סמן ביולוגי חיוני המשמש לזיהוי autophagy במערכות יונקים הוא חלבון המשויך microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), המהווה את הממברנה האוטופאגוסומלית. במהלך autophagy, cytosolic LC3-1 הוא מצומדות כדי phosphatidylethanolamine כדי ליצור LC3-II; LC3-II משולב אז לתוך קרום autophagosal 3 . סמן נוסף בשימוש נרחב עבור השטף autophagic הוא autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) אשר פיזית liמטען אוטופאגית אל הממברנה האוטופאטית 4 , 5 . שיטות אשר שימשו באופן מסורתי למדוד autophagy הם כתמים המערבי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7 . עם זאת, אף אחת משיטות אלה נחשבים &quot;תקן הזהב&quot; , 2 , 6 כמו ישנם אתגרים הקשורים בשתי הטכניקות הללו. כתמים מערביים נותנים רק בממוצע משום שהם משתמשים במדגם הומוגני, כך שצופים לא יכולים לראות מה קורה בתאים בודדים. מצד שני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נותן מידע צופה ברמה אחת התא, אבל זה חסר יכולות התפוקה, מה שהופך אותו קשה להשיג אובייקטיבי הערכות סטטיסטית קפדנית. בשנים האחרונות, את המדידה של LC3 ו p62 על ידי cytometry זרימת multispectral הדמיה (MIFC, ראה טבלה של חומרים ) כבר צובר popuLarity בשל כוח כמותי, יכולות תפוקה גבוהה, פוטנציאל ריבוב, ואת היכולת התמונה כל תא. אחת השיטות הנפוצות ביותר למדידת autophagy באמצעות MIFC, יחד עם תוכנת ניתוח לוויה שלה (ראה טבלה של חומרים ), היא באמצעות ספירת ספוט של LC3 puncta או autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . עם זאת, עלייה autophagosomes לא בהכרח אומר כי קיימת עלייה autophagy, כפי שהוא יכול גם לייצג המצור בתהליך 2 . מחזור LC3-II הוא פרמטר שימושי למדוד שטף autophagic על ידי ניתוח תאים בנוכחות והיעדר מעכב השפלה ליזוזומלית, כגון כלורוקין. Chloroquine מעכב את היתוך של autophagosome כדי lysosome, ובכך לאפשר את quantitation של היווצרות autophagosome כמדד של מידת autophagy על ידי עצירת השטף autophagic לפני השפלה lysosomal יכול להתרחש 18 . בנוסף, p62 הוא מושפל בעיקר על ידי autophagy, ואם השפלה ליזוזומלית של autophagosome ותכולתו חסומה, הצטברות של p62 צפוי 17 , 19 . Autophagy הוא תהליך multistep, ואת המדידה של LC3 או p62 לבד אינו מספק תמונה מלאה של מה שקורה בתאים. פרסומים אחרונים הדגישו את הצורך לבחון את התהוות בו זמנית של autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC הואבאופן ייחודי מסוגלים למדוד את ההיווצרות של autolysosome ידי הדמית שיתוף הלוקליזציה של autophagosome אל 15 הליזוזום - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. בנוסף, שיתוף לוקליזציה של p62 ו LC3 באמצעות MIFC יש גם נחקרו למדוד שטף autophagic 5 . בתוכנה ניתוח הפניה, &quot;תכונה&quot; זה מודד שיתוף לוקליזציה נקרא &quot;פרט מפורטת הדמיון R3&quot; (BDS) ו תוכנן במיוחד כדי להשוות את הפרטים הקטנים, התמונה בהירים של שתי תמונות. BDS הוא מקדם המתאם של Pearson המתאם ביומן של נקודות האור המצויות עם רדיוס של 3 פיקסלים או פחות; במילים אחרות, BDS מחשבת את מידת oוריקלינג פיקסלים משני ערוצי ניאון שונים. נקודות האור הן מתואמות ( כלומר, מיקום מרחבי זהה) או בלתי מתואמות ( כלומר, מיקומים מרחביים שונים). לכן, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח בין אפס לאינסוף 26 , 27 . BDS לבדה לא יכול להיות מספיק; Rajan et al. נמצא כי שימוש רק BDS יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות או שגויות שלילי 21 . BDS מעריך את שיתוף לוקליזציה של שני סמנים של autophagy אבל לא מחשיב את מספר autophagosomes. כדי להסביר את מספר autophagosomes, Rajan et al. כללה ספירת ספוט של LC3 puncta 21 . Rajan et al. המוצע באמצעות פיזור bivariate העלילה של ספירה LC3 ספוט לעומת BDS. באמצעות העלילה דו-שנתית זו, שתי אוכלוסיותE מזוהה הראשון: אחד עם תאים בעלי רמה גבוהה של כתמים LC3 ואחד עם תאים בעלי רמה נמוכה של כתמים LC3. אוכלוסיית הנקודה הגבוהה של LC3 סווגה לשתי אוכלוסיות: תאים עם לוקליזציה משותפת נמוכה ( כלומר, הצטברות של אוטופגוזומים) ותאים בעלי לוקליזציה גבוהה ( כלומר, הצטברות של אוטוליזוזומים). זו העלילה bivariate מאפשר להבחין בין תאים עם מעט מאוד autophagosoms ותאים עם הצטברות של autophagosomes ו / או autolysosomes 21 . עד כה, לוקליזציה משותפת של LC3, p62, LAMP1 (סמן lysosomal) לא היה אפשרי באמצעות &quot;סוג תכונה&quot; יחיד בתוכנת ניתוח לוויה MIFC (ראה טבלה של חומרים ). עם זאת, תכונה חדשה, הציג לאחרונה בגירסה 6.1, נקרא Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 משווה את התמונות פירוט בהיר מכל אחת משלוש התמונות (במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1) וכימות co-localization של שלושה בדיקות ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). תכונה BDC3 מחשב את מקדם המתאם של פירסון שונה כדי להאריך עד שלוש תמונות. מאחר והנקודות הבהירות בשלוש התמונות הן מתואמות או בלתי מתואמות, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח דינמי בין 0 ו אינסוף. על ידי החלפת תכונה BDS עם תכונה BDC3, שיטת הניתוח שהוצגו על ידי Rajan et al. יכול כעת לשלב את שלושת הסמנים המשמשים ביותר למדוד autophagy במערכת אחת בעת ובעונה אחת. היכולת co-localize אלה שלושה סמנים של autophagy ב assay אחד יכול להוביל תובנות הרומן לתוך אינדוקציה ו הרגולציה של autophagy. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים כדי לגרום autophagy בתאי Jurkat; תווית התאים עם LC3, p62, ו LAMP1 נוגדנים; לרכוש נתונים על multispEctral זרימת הדמיה cytometer; ולנתח את הנתונים כדי להעריך שטף autophagic.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagy הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים סלולריים נורמלי או מתפקדת כי לצבור במהלך הצמיחה והבחנה מושפלות באמצעות lysosome ו ממוחזרים. במהלך autophagy, חלבון LC3 cytoplasmic הוא lipidated וגויסו את הממברנות האוטופאגוסומליות. האוטופאגוזום מתמזג עם הליזוזום כדי ליצור את האוטוליזוזום, שם מתרחש התמוטטות שלפוחית ​​האוטופגוזום ותכולתו. חלבון ה- p62 הקשור ל- Ubiquitin, אשר נקשר ל- LC3, משמש גם לניטור השטף האוטופאגי. תאים שעוברים autophagy צריך להדגים את שיתוף לוקליזציה של p62, LC3, ו lysosomal סמנים. מיקרוסקופיה Immunofluorescence נעשה שימוש כדי לזהות חזותית LC3 puncta, p62, ו / או lysosomes על בסיס לכל תא. עם זאת, הערכה אובייקטיבית וסטטיסטית קפדנית יכול להיות קשה להשיג. כדי להתגבר על בעיות אלה, cytometry זרימת multispectral הדמיה שימש יחד עם תכונה אנליטית שמשווה את דה בהירהזנב תמונות של שלושה סמנים autophagy (LC3, p62 ו lysosomal LAMP1) ו לכמת שלהם שיתוף לוקליזציה, בשילוב עם ספירה LC3 ספירת למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

שיטה זו ניתוח משתמשת תכונות מרובות כדי התחת השטף autophagic. על מנת להבין את המגרש הדו-שנתי הסופי, יש לבחון תחילה את מאפייני הניתוח האינדיבידואליים. ספירת האוטופגוזומים היא דרך הגיונית למדידת אוטופאגי; עם זאת, גודל / צורה / בהירות של LC3 puncta יכול להשתנות באופן דרסטי בין תאים. וריאציה יכולה להקשות על ספירת האוטופגוזומים באופן ידני או באמצעות תכונה ספירת ספוט בתוכנת הניתוח. לכן, לא תכונה ספירת ספוט יהיה מושלם בשל השתנות זו גדולה autophagosomes. עם זאת, תכונה טובה ספירת נקודה יעבוד על רוב התאים 26 . איור 3 מציג דוגמאות של מסיכה ספוט של LC3 puncta בתאי Jurkat באמצעות מסכות ספוט שונים. התכונה ספירת ספוט שנבחרה עבור ערכת נתונים זו היא ספוט ספירת_מספר (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, כלומר התכונה ספירת ספירה ספרה את הנקודות שבהןAk מסומנת במסך ברירת המחדל של ערוץ 11 (M11) בערוץ 11 (Ch11-LC3-AF647) עם יחס רקע ל-תא של 4 (Bright, 4). איור 4 מציג ספירה ספירת היסטוגרמות ותמונות נציג עבור ספוט נקודה ממוצע של שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקין Jurkat שכותרתו אנטי LC3-AF647. שליטה ומורעבת ספירת ספירת ממוצע אינם שונים באופן משמעותי; עם תוספת של chloroquine, יש הבדל גדול בממוצע של כלורוקין + שליטה לעומת כלורוקין מורעב +. התכונה הבאה לחקור היא BDC3. BDC3 הוא מדידה של שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים / בדיקות, במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1. איור 5A - 5D מציג היסטוגרמות BDC3 עבור שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקווין Jurkat שכותרתו עם אנטי p62-AF488, אנטי LAMP1-PE, ו אנטי LC3-AF647. יש מעבר בין ממוצע שליטה לממוצע מורעב, כמו גם את השליטה + Chloroquine מתכוון למוות מורעב Chloroquine. עם זאת, מסתכל על התמונות של תאים מן הציונים BDC3 ממוצע בתרשים 5E - 5H , יש הבדל גדול יותר בין דגימות מאשר היסטוגרמות עשוי להוביל אחד להאמין. הסיבה לכך היא כי BDC3 אינו מחשיב את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך מידה רבה של השתנות במספר autophagosomes עבור ציון BDC3 אותו. ברוב המקרים, יש חפיפה בין כל שלושת הבדיקות, כי גם ברמות הבסיסיות, p62, LAMP1 ו- LC3 צריכים, במידה מסוימת, לשתף-מקום או להתגורר באזורים דומים בתאים. בניגוד לכך, דוגמה של שלושה בדיקות כי לא צריך שיתוף לוקליזציה הם אנטי p62-AF488, אנטי LC3-AF647, צבע DAPI גרעיני עבור מדגם מורעב + Chloroquine, שמוצג באיור 6. &lt;<html> / P&gt; כאשר תכונה ספירת ספוט התכונה BDC3 משולבים, נוכחות של subpopulations שונים המשפרים את היכולת להבחין בין הדוגמאות / התנאים השונים ניכרים. איור 7 מציג את חלקה דו-ספרתית של ספירת ספוט של LC3 לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 עבור ארבעת הדגימות: בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעבים, מורעבים + כלורוקין. מדגם הבקרה שימש כדי לקבוע את אסטרטגיית gating עבור שלוש אוכלוסיות: נקודות נמוכה, נקודות גבוהות / נמוך BDC3, ו גבוה כתמים / גבוהה BDC3. הדגימות בקרה הראו כי יותר מ 98% של תאים היו 1 או פחות כתמים. הגבול בין הנקודות הגבוהות / נמוך BDC3 ו גבוה כתמים / גבוה BDC3 נקבעה ציון BDC3 של 1 כי יותר מ 91% של מדגם בקרה היה ציון BDC3 פחות מ 1. סיכום של התוצאות עבור bivariate מגרשים מוצג בטבלה 1 . <html> גיל = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> איור 1: MIFC הגדרת מכשיר. צילום מסך של הגדרות מכשיר MIFC המשמש לניסוי זה, המתואר בשלב 8 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח תוכנה Gating אסטרטגיה. צילום מסך של תוכנת ניתוח gating התוכנית, המתואר בשלב 9 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 10&quot;ג them/ /&gt; איור 3: LC3 מסכת ספוט. Jurkat תא תמונות ומסיכות השתמשו כדי ליצור את ספירת ספירת תכונה. מודגשים (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), שיא (M11, Ch11-LC3-AF647) , מוארת, 5), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 5,3,1), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 6,2,1). המסכה שעבדה הכי טוב עבור כל התאים המוצגים היה שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> איור 4: LC3 ספירת ספירת היסטוגרמות. באמצעות ספירת ספוט תכונה ספוט Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 ו LC3-AF647 ספוט ספירת היסטוגרמות עבור בקרה ( A , כחול בהיר), שליטה + ChloroquinE ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ספירת הנקודות הממוצעת עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקואין הם 0.07, 1.13, 0.10, 2.77, בהתאמה. BF, LC3-AF647 (אדום), צבע DAPI גרעיני (כחול), וכן מורכב של LC3-AF647 ו תמונות DAPI של תאים נציג עבור ספוט נקודה ממוצע מוצגים עבור בקרה ( E , 0 כתמים), שליטה + Chloroquine ( F , 1 נקודה), מורעב ( G , 0 כתמים), מורעב + Chloroquine ( H , 3 כתמים). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> איור 5: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 היסטוגרמות עבורR שליטה ( A , כחול בהיר), שליטה + Chloroquine ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ציון BDC3 הממוצע עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקווין הם 0.57, 0.82, 0.74, ו 0.98, בהתאמה. BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ו - Composite של P62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות של תאים נציג של BDC3 הממוצע מוצגים שליטה ( E ), שליטה + כלורוקווין ( F ), מורעב ( G ), מורעב + כלורוקווין H). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> איור 6: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LC3 / DAPI עבור מדגם מורעב + Chloroquine. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI היסטוגרמה עבור מדגם מורעב + Chloroquine מוצג. הציון הממוצע של BDC3 הוא 0.07. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LC3-AF647 (אדום); DAPI (כחול); ואת מורכב של P62-AF488, LC3-AF647, ותמונות DAPI של תאים נציג עבור BDC3 הממוצע מוצג עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> איור 7: מגרשים דו-ספריים של LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( א ) חלקות Bivariate של ספירה LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 לבקרה, שליטה + כלורוקווין, מורעבים, מורעבים + כלורוקווין תאים Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ואת מרוכבים של p62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות משלושה אזורים ( כלומר, נמוך כתמים, כתמים גבוהים / נמוכה BDC3, גבוה כתמים / גבוה BDC3) מוצגים עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ספירת תאים </td><td> מוארת פירוט קולוקליזציה 3 ממוצע </td><td> ספירת ספוט LC3 ממוצע </td><td> נמוך נקודה </td><td> נקודה גבוהה / נמוכה BDC3 </td><td> נקודה גבוהה / גבוהה BDC3 </td></tr><tr><td> לִשְׁלוֹט </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> שליטה + כלורוקין </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> מוּרעָב </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> מורעבים + כלורוקין </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום Jorkat LC3 ספוט ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 חלקת Bivariate

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  MilliporeSigma.  הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית. 

Video: Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Bioengineering

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Engineering

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Cancer Research

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunology and Infection

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...