Il laboratorio Yeh è sostenuto da fondi per la ricerca da un American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) assegnato alla Hollings Cancer Center presso MUSC, da finanziamenti per la ricerca da un Dipartimento della Difesa di sovvenzione (W81XWH-11-2- 0229) a MUSC, e un premio dalla Fondazione Concern (a ESY).

Il protocollo segue le linee guida e gli standard di cura degli animali della Medical University of South Carolina (MUSC) e la sua Animal Care istituzionali e del Comitato uso (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Mammaria dissezione del tumore (opzionale a seconda degli obiettivi di studio e se analisi tumore primario o coda vena iniezione è stata eseguita). <ol><li> Euthanize mouse utilizzando una dose letale di anestesia isoflurano secondo IACUC e regolamentazione università. Confermare euthanization da lussazione chirurgica. </li><li> A bordo della gomma piuma, poli con perni dissezione mettendo mouse sulla sua schiena con gli arti diffusione. </li><li> Spray mouse con etanolo al 70%. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare la parte inferiore dell&#39;animale al centro. </li><li> Usando forbici, tagliare verso l&#39;alto verso il collo attraverso la pelle, facendo attenzione a non forare la cavità peritoneale del mouse. </li><li> Tagliare la pelle agli arti per rivelare tessuto tumorale. </li><li> Sezionare tessuto tumorale e preserve dal metodo preferito, come il congelamento o fissazione, per ulteriore analisi (non discusso ulteriormente in questo protocollo). </li></ol></li><li> Dissezione tessuto polmonare. <ol><li> Se il tessuto tumorale è stato raccolto come descritto sopra, definire con precisione qualsiasi eccesso di pelle. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare peritoneo alla estremità inferiore dell&#39;animale e iniziare il taglio verso l&#39;alto verso la base del collo. </li><li> Tagliare con cautela lungo i lati sinistro e destro della gabbia toracica facendo attenzione ad evitare eventuali recidere vasi sanguigni che possono sanguinare nella cavità toracica. Rimuovere le costole tagliando a sinistra ea destra attraverso il diaframma e superiore porzioni della gabbia toracica. </li><li> Utilizzando pinze afferrare la trachea del mouse e tirare avanti. </li><li> Sever la trachea con le forbici dissezione e rimuovere polmoni di mouse. Nota: Il cuore può rimanere attaccato al polmone. In questo caso, sezionare accuratamente cuore lontano dai polmoni avendo cura di raccogliere tutti i cinque lobi (vedi Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Lavare delicatamente con PBS per rimuovere il sangue in eccesso. </li></ol></li><li> La valutazione al lordo del tessuto polmonare. <ol><li> Opzione 1: imaging in vivo. <ol><li> Per l&#39;imaging luciferasi, ~ 10 minuti prima di imaging, dare un 150 animali dose mg / kg di luciferina da intraperitoneale (ip) iniezione. Polmoni Immagine in vivo in animali anestetizzati o dopo la rimozione dopo la dissezione (Figura 2) 5. </li></ol></li><li> Opzione 2: valutazione lorda. <ol><li> Esaminare polmoni sotto stereo microscopio per visualizzare noduli tumorali. Nota: Se le cellule sono GFP etichettati, uno stereomicroscopio capace fluorescenza contenente un cubo di luce con i massimi di eccitazione / emissione appropriata (ad esempio vicino 470/510 nm) per rilevare GFP può essere utilizzato per esaminare polmoni stereoscopicamente per fluorescenza prima della lavorazione. </li></ol></li><li> Se i polmoni devono essere analizzati immediatamente, passare alla sezione &#39;RNA Isolation&#39;. In caso contrario, far scattare il tessuto freeze usando sapone liquidid azoto o ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. RNA Isolation Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, l&#39;RNA è stato isolato utilizzando un kit di isolamento di RNA (vedi Lista dei materiali). Mentre l&#39;analisi attuale utilizza prodotto uno specifico produttore, una varietà di kit di isolamento sono disponibili da diversi fornitori affidabili. Inoltre, i metodi di centrifugazione non a base di kit sono anche un&#39;opzione. cDNA dovrebbe anche essere preparata da un campione di controllo di RNA positivo, come una linea cellulare o plasmide, per l&#39;analisi della curva standard. In alternativa, un controllo positivo specifica per il set di sonde di primer può essere acquistato (vedi Materiali List). <ol><li> Se si utilizza il tessuto precedentemente congelato, raccogliere tessuto congelato in ghiaccio secco. </li><li> Omogeneizzare tessuto utilizzando uno dei seguenti metodi come: mortaio e pestello macinazione eseguito a mano in ghiaccio secco dopo il congelamento del tessuto in azoto liquido; omogeneizzatore tessuto o un dispositivo meccanico di dissociazioneda suggerimento del produttore; sonicazione, o altro metodo preferito. Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, il metodo preferito di omogeneizzazione è sonicazione. <ol><li> Per l&#39;analisi presentata nella figura 3, preparare tampone di lisi (fornito nel kit di isolamento di RNA) e 2-mercaptoetanolo ad un rapporto di 20 microlitri 2-mercaptoetanolo per ogni 1 ml di tampone di lisi. Tessuto risospendere in 300 microlitri tampone di lisi completato con 2-mercaptoetanolo per ogni 30 g di tessuto e ultrasuoni per 10 sec con sonicatore fissata al 30% di ampiezza. </li><li> Se si usa mortaio e pestello, il tessuto terra risospendere in tampone di lisi 300 ml dopo la rettifica. </li></ol></li><li> Aggiungere 10 ml proteinasi K a 590 microlitri tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Aggiungere 600 microlitri soluzione proteinasi K per ogni 300 ml (ossia per ogni 30 mg) di tessuto. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Nota: il tempo di digestione può variare. </li><li> Centrifugare i campioni a ≥13000 g per 10 minuti per rimuovere i detriti. </li><li> Trasferire il surnatante di nuovi tubi. </li><li> Aggiungere 450 microlitri di etanolo (96% -100%) per ogni 900 ml di surnatante di precipitare l&#39;RNA. </li><li> Trasferire 700 microlitri della miscela lisato / etanolo alla colonna. </li><li> Centrifugare i campioni a ≥13,000 g per 1 minuto per legare l&#39;RNA alla colonna. </li><li> Smaltire i rifiuti liquidi e aggiungere restante surnatante in colonna e far girare di nuovo. </li><li> Una volta che tutto il lisato viene centrifugato attraverso la colonna, aggiungere 350 ml di tampone di lavaggio 1 alla parte superiore dei campioni colonna e centrifugare a ≥13,000 g per 30 sec. </li><li> Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore. </li><li> Preparare DNase mescolando 5 unità di DNasi I dell&#39;enzima con 5 ml di 10x DNasi e 40 ml di DNasi / RNasi acqua libera per campione (volume totale di 50 microlitri / campione). </li><li> Aggiungere 50 ml di DNasi mescolano a ogni colonna e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 350 ml di tampone di lavaggio da 1 a colonna e centrifugare samples a ≥13,000 g per 30 sec. </li><li> Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore. </li><li> Aggiungere 600 ml di tampone di lavaggio 2 alla colonna e spin 30 sec a ≥13,000 g. </li><li> Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone di lavaggio 2 e centrifugare per 2 min a ≥13,000 g. </li><li> Mettete parte di colonna in nuovo tubo di raccolta ed eliminare vecchio tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere 50-100 ml di RNasi / DNasi acqua libera alla colonna e incubare per 1 min. </li><li> Spin per 1 min a ≥13,000 g. </li><li> Eseguire nuovamente eluato raccolte attraverso colonna per aumentare la resa di RNA. </li><li> Per l&#39;uso immediato, mantenere i campioni sul ghiaccio e procedere alla quantificazione. Per un uso successivo, scatto congelamento ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare a -80 ° C freezer fino al momento. </li></ol> 3. First Strand Synthesis Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, la trascrittasi inversa (RT) è stata eseguita una reazione Fkit di sintesi irst Strand cDNA progettato per QRT-PCR (vedi Lista dei materiali). <ol><li> Se i campioni sono stati raccolti in precedenza, scongelare i tubi su ghiaccio. </li><li> Misurare la quantità di RNA utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Utilizzando 0,5-2 mg di RNA totale, eseguire prima sintesi filone utilizzando trascrittasi inversa per generare cDNA magazzino. <ol><li> In sterili, tubi RNasi / PCR-free DNasi / piastre, preparare la miscela di reazione (Tabella 1). Mescolare delicatamente e centrifugare. Programmare una macchina di PCR standard (Tabella 2). </li></ol></li><li> Diluire reazione finito al volume desiderato (generalmente 50-100 ml) con acqua priva di nucleasi sterile. </li></ol> 4. Real-time PCR Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, è stato utilizzato SYBR green. Tuttavia, qualsiasi metodo preferito può essere sostituito a discrezione dell&#39;utente. <ol><li> Usando un cDNA controllo positivo, impostare una curva standard per ogni set di primer. <ol><li> Per l&#39;analisi illustrato in Figura 3, preparare la curva standard per HER2 umano con il produttore raccomandato cDNA controllo positivo (vedi Lista dei materiali). Per il mouse GAPDH, utilizzare il negativo cDNA di controllo del polmone per generare una curva standard. Per ciascuna sonda, in serie diluire il cDNA 1: 4 per generare 5 standard. </li></ol></li><li> Calcolare il numero di campioni totali, che dovrebbe includere la curva standard e campioni sperimentali. Nota: Per l&#39;analisi qui descritta, 2-3 repliche sperimentali per campione sono stati analizzati. Analisi della curva standard è stata eseguita per generare un modello di regressione lineare semplice che può essere applicato per determinare la quantità relativa di HER2 e GAPDH per campione calcolare quantità normalizzata finale. Questa analisi inoltre garantire che l&#39;efficienza primer è adeguata per l&#39;analisi a mano. </li><li> In una, RNasi / tubo-free DNasi sterili, preparare master mix (Tabella 3). <ol><li> Calcola Master Mix Amount per campione. Scala per più di un campione. Utilizzare un master mix per ogni gene sperimentale di interesse, così come un controllo interno, come GAPDH. Utilizzare primers per GAPDH ad una concentrazione finale di 200 nM. Nota: Il controllo interno è particolarmente utile quando si cerca di distinguere tra l&#39;origine delle cellule umane e mouse. Nota: concentrazione Primer per HER2 è stata ottimizzata e determinato dal produttore. </li></ol></li><li> Preparare piastra di prova contenente 1 cDNAs microlitri corrispondenti a ciascun campione standard o sperimentale. Allocare almeno 1 cDNA campione / bene per ogni sonda primer. Aggiungere 19 ml di Master Mix per pozzetto per ogni sonda primer. Nota: Per i dati rappresentativi della figura 3, i campioni di cDNA sono stati analizzati in duplicato per ciascuna sonda primer e graficamente come media dei due campioni. </li><li> Reazione Esegui in macchina QRT-PCR utilizzando consigliato o precedentemente testato protocollo PCR. Vedere la Tabella 4 </sTrong&gt; per il protocollo PCR utilizzato per i dati rappresentativi in Figura 3 e Figura 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY e MAA non sono dipendenti di FirstString Research Inc. e non detengono alcun interesse finanziario nella società. FirstString Research Inc. ha fornito i dati di imaging luciferasi che è stato presentato in questo manoscritto. GSG è presidente e CEO di FirstString Research. CLG è un dipendente di FirstString Research. GSG e CLG hanno stock option emesse dalla FirstString Research.

Questo protocollo descrive l&#39;uso di QRT-PCR per valutare mammaria le metastasi delle cellule tumorali al polmone utilizzando un modello murino di xenotrapianto. Si riconosce che altre tecniche, tra cui l&#39;imaging bioluminescente, sono disponibili e sono anche efficaci per la rilevazione di metastasi pur avendo i propri valori e limiti. I dati presentati indicano che QRT-PCR fornisce una misura efficace di rilevamento dell&#39;mRNA derivate da tumore all&#39;interno di tessuto polmonare per la quantificazione dell...

Analisi RT-PCR si propone come un metodo per valutare metastasi tumorali. Questo metodo si propone come alternativa per gli utenti che sono interessati a valutare le metastasi, ma non possono avere accesso alle attrezzature specifiche quali attrezzature imaging in vivo o una fluorescenza stereoscopio capace. Una discussione dei metodi comunemente usati è presentato seguita da una dimostrazione di come l&#39;analisi RT-PCR può essere usato sia come separato o come un metodo per valutare guidata metastasi. Questa procedura ha il potenziale per fornire un&#39;analisi quantitativa di carico metastatico. Metodi standard di analisi lordo, tra cui la visualizzazione dei polmoni allo stereomicroscopio nonché sezionamento seriale seguita da ematossilina eosina (H &amp; E) la colorazione del tessuto polmonare, sono quantificabili ma fanno molto affidamento su parametri definiti dall&#39;utente per il conteggio 2-5. Nel valutare i polmoni interi utilizzando uno stereomicroscopio, solo le grandi metastasi di superficie sono visibile e analisi richiede l&#39;investigatore di avere ragionevole conoscenza della struttura anatomica del polmone a determinare ciò che costituisce una lesione metastatica. Marcatura fluorescente di cellule tumorali con un marcatore, come GFP e l&#39;uso di uno stereomicroscopio che contiene un cubo di luce con i massimi appropriata di eccitazione / emissione (ad esempio vicino 470/510 nm per GFP) aiuta in questo processo, ma solo noduli tumorali superficie sono rilevabili . Inoltre, la fluorescenza dalla contaminazione del sangue, che è visibile sotto gli stessi parametri GFP, può portare a false identificazione di possibili lesioni metastatiche. Sezionamento del polmone seguita da colorazione H &amp; E di visualizzare metastasi polmonari è un metodo utile per valutare micrometastasi e altri processi microscopici, tra cui l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie, ma spesso richiede l&#39;uso di tutto il tessuto polmonare per paraffina, sezionamento, e procedure di colorazione. Pertanto, le procedure a valle non sono ideali seguendo questo method. Sebbene quantificabile, questa procedura richiede al ricercatore di valutare un gran numero di sezioni polmonari colorate per animale per garantire che l&#39;analisi dei bilanci dell&#39;intera struttura 3D del polmone. Di conseguenza, questo tipo di esame è molto tempo, può portare ad errori di conteggio e analisi dipende fortemente investigatore discrezione. Diversi in tecniche di imaging in vivo (ad esempio la risonanza magnetica, PET, SPECT) sono attualmente utilizzate per eseguire o testare i processi biologici in modelli di roditori sperimentali 8. Imaging in vivo bioluminescente è un metodo comune utilizzato per acquisire una visione lordo di metastasi 9. Questa tecnica è generalmente applicato per valutare la presenza di attività della luciferasi dovuto all&#39;accumulo di cellule tumorali, che sono progettati per contenere un elemento di risposta luciferasi, che risiedono in organi specifici come la ghiandola mammaria dopo l&#39;impianto delle cellule tumorali e il polmone su metastasi spontanea 10. La visualizzazione di attività della luciferasi è indotta dalla presenza del substrato luciferina (D-luciferina). Luciferasi catalizza la decarbossilazione ossidativa di D-luciferina per oxyluciferin generare bioluminescenza. Mentre informativo, questo metodo è limitata da diversi fattori tra cui la stabilità del substrato (es emivita breve), adeguata distribuzione di substrato, che dipende da come viene consegnato a animali da esperimento, e la bassa sensibilità di rilevazione 9. Un merito principale di questa tecnica è che è non invasivo, può essere eseguita su animali vivi, e può portare alla rilevazione di metastasi delle cellule tumorali in diversi organi che non può essere normalmente raccolte a dissezione 9,10. Un aspetto positivo delle tecniche di imaging in vivo è che il tessuto polmonare è indisturbato permettendo per le procedure secondari come paraffina o come presentato qui, analisi QRT-PCR. Tuttavia, poiché QRT-PCR è Theoretically una misura più sensibile di rilevazione, la valutazione lordo non può rivelare un basso numero di cellule presenti nel polmone tumore. Mentre utile, le tecniche di imaging sopra descritti possono essere sostituiti o integrati con il metodo RT-PCR attualmente descritto. QRT-PCR ha il potenziale per fornire una misura sensibile di mRNA derivate da tumore all&#39;interno di un polmone.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

La malattia metastatica è la diffusione delle cellule tumorali maligne dal sito cancro primario di un organo lontana ed è la causa primaria di cancro associato alla morte 1. Comuni sedi di diffusione metastatica includono polmone, linfonodi, cervello, ossa e 2. Meccanismi che guidano le metastasi sono zone intense di ricerca sul cancro. Di conseguenza, le analisi efficaci per misurare onere metastatico in siti distanti di metastasi sono strumentali per la ricerca sul cancro. Valutazione delle metastasi polmonari in modelli di tumore mammario viene generalmente effettuata attraverso l&#39;osservazione qualitativa lordo del tessuto polmonare dopo dissezione. Metodi quantitativi per valutare le metastasi si limitano attualmente ex vivo e in tecniche di imaging basato vivo che richiedono parametri definiti dall&#39;utente. Molte di queste tecniche sono al di organismo intero piuttosto che il livello cellulare 3-6. Anche se i metodi di imaging più recenti che utilizzano la microscopia multi-fotone sono in grado di valutare metastasiTASIS a livello cellulare 7, questi altamente eleganti procedure sono più adatti a valutare i meccanismi di diffusione piuttosto che la valutazione quantitativa degli oneri metastatico. Qui, un semplice metodo in vitro per valutare quantitativamente metastasi è presentato. Utilizzando quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR), cellule tumorali mRNA specifico può essere rilevato all&#39;interno del tessuto polmonare del mouse.

Al di là del tempo necessario per eseguire l&#39;inoculazione iniziale di cellule tumorali in animali sperimentali e se si esegue, in analisi primaria del tumore in vivo, la raccolta dei tessuti, isolamento dell&#39;RNA, e l&#39;analisi RT-PCR è una procedura 1-2 giorni (figura 1) . Un esempio di analisi lordo è l&#39;imaging bioluminescente valutare cellule tumorali nel tessuto polmonare....

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l&#39;mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all&#39;interno del tessuto polmonare del mouse.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Views.  Medical University of South Carolina.  Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l'mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all'interno del tessuto polmonare del mouse. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Modelli di metastasi ossee

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...