The authors thank Mona Chambers, Geoffrey Hidalgo and Maurissa Two Two for their technical assistance. We also thank Dr. Earl White for amino acid analysis, Dr. Roger Simonds for analysis of pollen for pesticides, and Drs. Stanley S. Schneider, Vanessa Corby-Harris and Kirk Anderson for their reviews and discussion of earlier versions of the manuscript and many helpful suggestions.

1. Ottenere beebread da AHB e EHB Colonie <ol><li> Mettere trappole polline sul miele colonie di api e raccogliere il polline. Macinare il polline in una polvere fine (simile a polline far da antere) con un macinino da caffè. </li><li> Stabilire 5 colonie ciascuno di AHB e EHB in un&#39;area recintata di volo (EFA), in modo che le api foraggio solo sul polline fornito. Per evitare che i lavoratori alla deriva tra EHB e colonie AHB, dividere la EFA in sezioni separate, in modo che le api non possono attraversare tra di loro. Mettere EHB individuo o colonie AHB con 3500-4000 api operaie, pettine di cera con nettare, miele, covata immaturo e pettine vuoto in ogni sezione del EFA. NOTA: Le colonie non hanno conservato il polline quando stabilito. La velocità che il polline viene memorizzato può essere aumentato di non includendo una regina, che nelle colonie. </li><li> Feed polline terra per colonie inserendo un vassoio con il polline in ogni sezione del EFA. Diffusione circa 60 g di polline su ciascun vassoio in modo che foraging api possono ritirarla carichi come corbicular e conservare il polline nelle loro colonie come beebread. Continuare fornendo polline fresco su ciascun vassoio giorno per 3 settimane. </li><li> Fare riferimento alle beebread dalle colonie europee beebread europeo (EBB), e da colonie africanizzate come beebread africanizzate (ABB). </li></ol> 2. Api di alimentazione in gabbie <ol><li> Luogo fotogrammi di sigillato covata lavoratore AHB e EHB colonie in gabbie emergenza separati in una camera ambientale fissati a 32-34 ° C e il 40% di umidità relativa .. </li><li> Quando gli operai emergono e sono circa 24 ore di età, stabilire 12 plexiglas biodosaggio gabbie (dimensioni = 11,5 x 7,5 x 16,5 centimetri 3) e aggiungere o 100 EHB appena emerse o 100 nuovi emersi AHB api operaie per ogni gabbia. Mettere una sezione di pettine con un numero noto di cellule sia EBB o ABB (24-30 cellule per gabbia) in ogni gabbia per generare le seguenti combinazioni di trattamento: AHB fed ABB, EHB fed ABB, AHB nutriti EBB e EHB fed EBB. (4 trattamenti; 6gabbie per il trattamento; 24 gabbie in totale). </li><li> Aggiungi fiale di acqua e un miele del 50% e la soluzione di acqua formulati in volume per ogni gabbia. Riempire i flaconi miele e acqua al giorno per il periodo di studio 11 giorni. </li></ol> 3. Api campionamento dei lavoratori e beebread e stima del consumo <ol><li> Esempio 10 recentemente emerse EHB e AHB lavoratori prima di metterli nelle gabbie. Fare riferimento a questi come giorno 0 api e li servono come base per concentrazioni di proteine ​​emolinfa. </li><li> Rimuovere 10 api da ogni gabbia dopo che nutrivano EBB o ABB per 4, 7, e 11 giorni. </li><li> Posizionare le api vive in tubi microcentrifuga individuali e impostare su impacchi di ghiaccio. Selezionare un sottocampione di quattro api per l&#39;analisi della concentrazione di proteine ​​emolinfa. </li><li> Dopo aver assaggiato le api il giorno-11, contare il numero di celle a pettine che contengono ancora beebread. Si tratta di una misura relativa del consumo beebread. </li><li> Rimuovere il beebread restante dalle cellule in ogni gabbia e memorizzare in SEPARmangiato microprovette secondo gabbia. Mantenere i campioni beebread a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi per pH, concentrazione di proteine ​​solubili, e il contenuto di amminoacidi. </li></ol> 4. Stima pH di polline e pappa reale di api <ol><li> Prendete sei casuali 0,3 g campioni di polline alimentato per le api nel EFA e farla sciogliere in 300 ml di acqua distillata. Misurare il pH con un impermeabile doppia giunzione pH lancia con una precisione di 0,01. </li><li> Prendere 0,3 g campione di beebread che è rimasto dopo il periodo di alimentazione di 11 giorni in ogni gabbia. Sciogliere il beebread in 300 ml di acqua distillata e la misura del pH come descritto per polline (4.1). </li></ol> Analisi 5. Proteine <ol><li> Prendete sei campioni di polline e di un campione di EBB e ABB da ogni gabbia. Conservare i campioni a -20 ° C fino analizzati per la concentrazione di proteina solubile. </li><li> Mescolare 20 mg di una polline o beebread con 1.000 ml di 0,1 M tampone fosfato (PBS). </li><li> VoRTEX la miscela per 10 secondi e centrifugare a 571,2 g per 1 min. </li><li> Rimuovere un campione di 10 ml del surnatante e posto in pozzetti di una ben fondo piatto lastra di polistirene 96 EIA / RIA. Replicare ogni campione in tre pozzi. </li><li> Disegnare emolinfa dalle api raccolte da ogni gabbia inserendo un tubo capillare 20 microlitri (che era stato riscaldato e tirato ad un punto ago-sharp) nella porzione laterale destra del torace vicino al punto di attacco delle ali. Raccogliere emolinfa aggiuntivo, se necessario, inserendo lo stesso tubo nella membrana tra le tergiti addominali. </li><li> Aggiungere 1 ml di emolinfa a 9 ml di 0,1 M PBS. Conservare la soluzione emolinfa a -20 ° C fino all&#39;analisi per proteina solubile. </li><li> Determinare totale concentrazioni di proteine ​​solubili nel polline, pappa reale di api, e campioni emolinfa utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​Bradford commerciale. Seguire le istruzioni del produttore. </li><li> Stabilire una curva standard per stimare proteina solubile concentration nei campioni misurando proteina assorbanza con concentrazioni di proteine ​​note in albumina di siero bovino (BSA). Misurare proteina assorbanza a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro. </li></ol> 6. Amino Acid Analysis <ol><li> Piscina campioni individuali da cellule favo di ogni colonia per creare un campione rappresentativo di EBB e ABB per l&#39;analisi. </li><li> Prendete un 50 mg di polline o campione beebread pesato in vial, e aggiungere 1 ml di acqua distillata al flacone, insieme a 100 ml di una soluzione di 50 ng / ml di standard interno costituito da d 4 -alanina, d 23 Acido -lauric, 13 C 6 Glucosio e d 39 acido -arachidiac. </li><li> Tappare il campione e ultrasuoni per 5 min. </li><li> Presupposti una cartuccia HLB aggiungendo 1 ml di metanolo, equilibrato aggiungendo 1 ml di acqua distillata seguita dalla aggiunta di 1 ml del campione beebread o il polline. Lavare la cartuccia con 1 ml di 5,0% MeOH / H 2 O e Elute con 1 ml di 80% MeOH / H 2 O. </li><li> Evaporare il campione a secco sotto corrente di azoto. Ricostituire il campione con 50 ml di piridina e 100 ml di N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetammide + Trimetilclorosilano (BSTFA + TMCS). </li><li> Cap e incubare il campione a 70 ° C per 30 min. </li><li> Lasciare raffreddare il campione e trasferirlo ad un campionatore provetta pulita. </li><li> Cap e posizionare il campione in un rivelatore selettivo di massa interfacciati ad un gas cromatografo per analizzare i campioni sia per i composti volatili e acidi organici. Separare gli zuccheri e acidi organici seguenti TMS derivatizzazione con BSTFA + TMCS usando una colonna (30 mx 0,25 mm di diametro) con spessore 1,0 micron pellicola. </li><li> Impostare il forno a colonna a 50 ° C per 2 min, quindi aumentare la temperatura linearmente a 290 ° C a 5 C / min. e tenere premuto per 7 min. Impostare l&#39;iniettore GC e GC interfaccia / MS a 250 ° C e 290 ° C rispettivamente. <ol><li> Utilizzare elio come vettore in un flotasso w di 1,0 ml / min. Impostare la temperatura della sorgente di MS a 230 ° C. </li></ol></li><li> Tune e calibrare lo spettrometro di massa ogni giorno con perflurotributilammina (parte dell&#39;PFTBA). Utilizzare una iniezione 1 ml di parte dell&#39;PFTBA nella scansione completa (35-700 amu) modalità ioni positivi per ottenere dati sulla presenza e concentrazione di aminoacidi. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo scoperto che il beebread fatta da AHB è stato consumato in quantità maggiore da parte sia AHB e EHB. Sebbene EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread, AHB aveva maggiori emolinfa titoli di proteine. I risultati basati sui nostri metodi erano simili ai precedenti, dove i livelli di proteina emolinfa in AHB erano superiori in EHB se entrambi sono stati alimentati la stessa dieta 26. Misurando il consumo di EBB e ABB che sono stati consumati a velocità diverse da parte sia EHB e AHB, è stato stabilito che la concentrazione di proteine ​​emolinfa in ogni sottospecie non poteva essere sollevata, aumentando il consumo di cibo. Sembra che ci sia un plateau di concentrazione di proteine ​​emolinfa in lavoratori di età infermiere api e che il set point per l&#39;altopiano è più alto in AHB di EHB. Ci sono diverse condizioni importanti per stabilire colonie per la produzione di pappa reale di api che ottimizzano la velocità di archiviazione polline. Innanzitutto, la colonies bisogno telai con covata aperta. Senza covata aperta per nutrire, i lavoratori non raccoglie molto polline. In secondo luogo, la colonia deve essere queenless quindi non covata addizionale viene prodotto. Brood allevamento richiede grandi quantità di polline, e solo il polline in eccesso viene immagazzinata. Nelle piccole colonie stabilite in EFA, ci sarebbe poco di polline deve essere conservato come beebread se le aree di covata sono state espandendo così le colonie devono essere queenless. Infine, per beebread da effettuare, il polline deve essere raccolto come carichi corbicular e conservato in celle pettine. Se il polline viene raccolto in trappole polline, deve essere ridotta in polvere fine, prima di fare le api modo che possano raccogliere come carichi corbicular. I metodi per misurare il consumo di beebread generato qualitative piuttosto che stime assolute. L&#39;unico consumo che è stato contato è stato quando le cellule sono state completamente svuotate di pane d&#39;api. Una stima più accurata del consumo totale pane ape può essere ottenuta rimuovendo il br apeead dalle cellule e farne una polpetta che potrebbe essere pesati prima e dopo il periodo di studio. Tuttavia, abbiamo voluto mantenere il pane ape nelle cellule in modo che le api potrebbero nutrirsi di esso come farebbero in una colonia e forse continuare l&#39;elaborazione durante il periodo di studio. La differenza di peso delle sezioni pettine prima e dopo lo studio non è stato usato come stima del consumo perché il peso potrebbe aumentare perché api mettere il miele diluito alimentato loro in alcune cellule. I lavoratori potrebbero anche hanno aggiunto alcuni del miele diluito al pane d&#39;api. Per queste ragioni, cellule contenenti approssimativamente uguali quantità di pane ape prima e dopo il periodo di alimentazione sono state contate e generati una misura qualitativa. Tuttavia, vi era una differenza evidente tra i due tipi di beebread del numero di celle vuote ABB contate rispetto EBB dopo 11 giorni. Determinare quando polline conservato diventa beebread può essere difficult perché le api aggiungono continuamente polline per le cellule. Le colonie usate per la produzione di pappa reale di api sono state stabilite con cornici di covata aperte così le api sarebbero raccogliere il polline. Tuttavia, le colonie erano queenless quindi c&#39;erano larve per alimentare solo per circa 9 giorni dopo la colonia è stata stabilita. Per il resto del periodo di 3 settimane, quando le colonie erano in EFA, il polline che le api raccolti sono stati conservati e di essere convertiti in beebread. Mantenere il polline immagazzinato nelle cellule pettine per ulteriori 11 giorni in cui l&#39;alimentazione è per le api in gabbie anche può aver continuato il trattamento di polline beebread. La conversione di polline al pane d&#39;api richiede circa 7 giorni 8. Il beebread alimentato a EHB e AHB aveva minore pH e concentrazioni di proteine ​​ridotte rispetto alla Fed polline. Risultati simili di cambiamenti nel polline dopo beebread conversione sono stati segnalati da altri 7,10,27. I nostri risultati differiscono da precedenti relazioni tuttavia, in che c&#39;erano differenze nelle concentrazioni of alcuni aminoacidi tra beebread e polline. I cambiamenti in entrambe le concentrazioni di acido proteine ​​e aminoacidi potrebbe essere dovuta all&#39;attività di enzimi proteolitici, la cui fonte potrebbe essere le api stesse o delle comunità microbiche stabiliti nel beebread 7,8,28,29. I metodi utilizzati per misurare la concentrazione della proteina erano simili a quelli precedentemente descritti per determinare gli effetti di proteine ​​alimentari su Africanized e api europee 26. Come estensione dei metodi, siamo stati in grado di stimare proteina solubile nel polline e pappa reale di api. Tali metodi hanno generato risultati simili a precedenti rapporti 7,10,27. I nostri risultati forniscono ulteriori prove che AHB più efficiente assimilare proteine ​​nella dieta di EHB, e che questo potrebbe essere un fattore chiave per il dominio ecologico di AHB nella maggior parte delle regioni in cui è emigrato e affermata 30-32.

La nutrizione gioca un ruolo fondamentale nella salute e il vigore di miele colonie di api e nel loro stabilimento come popolazioni. Nutrienti dal cibo forniscono energia e componenti biochimici necessari per allevamento della covata, termoregolazione, foraggiamento e la risposta immunitaria. Per miele colonie di api, i nutrienti necessari per crescere popolazioni delle colonie e mantenere la loro salute viene da nettare e polline. Nettare fornisce carboidrati e polline fornisce le esigenze alimentari restanti quali proteine, lipidi, vitamine e minerali 1. Sottospecie di api possono differire nei parametri a livello di colonia a base nutrizionale come la longevità lavoratore, covata allevamento, e meccanismi di immunità sociale 2-6. Queste differenze possono essere collegati a come il cibo, specialmente il polline viene elaborato dalla colonia e digerito in individui. Il polline è immagazzinato nelle cellule pettine e attraverso microbiologicamente mediato fermentazione lattica viene modificato chimicamente <sup&gt; 7-10. Il polline fermentato si chiama beebread. Ci potrebbero essere delle differenze genotipiche tra sottospecie nella loro capacità di acquisire le sostanze nutritive dal polline che raccolgono e memorizzare e questo potrebbe influenzare la crescita e la sopravvivenza delle colonie. Effetti genotipici sulla trasformazione dei prodotti alimentari e l&#39;acquisizione dei nutrienti sono stati documentati in altri organismi che causano alcuni individui di ottenere più sostanze nutritive e calorie rispetto ad altri consumando gli stessi cibi 11-14. Qui si descrivono i metodi utilizzati per confrontare la composizione e il consumo di beebread fatta da diverse sottospecie di api. Metodi per misurare le conseguenti emolinfa titoli di proteine ​​in api operaie sono anche descritti. Precedenti studi sulla composizione nutrizionale del beebread sono stati fatti con le api europee miele (EHB) 10,15,16. Tuttavia, ci possono essere differenze di beebread fatta da api di diverse sottospecie, anche quando si nutrono lo stesso polline. EHB e AHB sono stati confrontati, perché questi subwooferpecies hanno differenze comportamentali e fisiologiche distinte che potrebbero essere collegati alla trasformazione dei prodotti alimentari e dei nutrienti acquisizione 17. Alcune delle differenze più importanti sono che AHB raccogliere e consumare più polline di EHB e sembrano per convertire più facilmente in covata 18. Colonie AHB hanno tassi più elevati rispetto brulicanti EHB e tentare la fuga, quando le risorse alimentari diventano limitate 19-23. Fuga è rara in EHB. AHB hanno anche tassi metabolici più elevati rispetto EHB 24. La base nutrizionale per le differenze a livello di colonia tra EHB e AHB potrebbe essere correlato al tasso di raccolta del polline e anche per il suo contenuto di nutrienti (ad esempio, aminoacidi e proteine) dopo che è stato convertito in beebread. Consumo beebread e la conseguente acquisizione di proteine ​​anche potrebbero svolgere un ruolo nelle differenze a livello di colonia tra EHB e AHB. Utilizzando i metodi sviluppati, EHB e AHB reso beebread dalla stessa fonte di polline. La pappa reale di api è stata reimmessa alle api di each sottospecie e potrebbe determinare se api acquisiscono proteine ​​da beebread in modo distintivo ai loro sottospecie o alla fonte del beebread.

<table><tbody><tr><td>waterproof double junction pH spear&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coffee Grinder</td><td>Mr. Coffee&amp;nbsp;</td><td>model 1DS77</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffer solution</td><td>Emd-millipore</td><td>BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>EIA/RIA polystyrene plate</td><td>Sigma-Aldrich-Corning</td><td>CLS3590-100EA</td><td></td></tr><tr><td>microcapillary pipets</td><td>Kimble Glass Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#500-0202</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biotek Synergy HT&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass Selective Detector&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5973N</td><td></td></tr><tr><td>HLB cartridge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gas chromatograph&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>6930</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;gas chromatography column&amp;nbsp;</td><td>A J&amp;amp;W Scientific&amp;nbsp;</td><td>DB-1701</td><td></td></tr><tr><td>d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-alanine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>488917</td><td></td></tr><tr><td>d&lt;sub&gt;23&lt;/sub&gt;-lauric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide +&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33148</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorotributylamine (PFTBA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442747-U</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;d39&lt;/sup&gt;-arachidiac acid</td><td>Cambridge Isotope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for comparing nutrients in beebread made by africanized and european honey bees and the effects on hemolymph protein titers

Le api da miele ottenere nutrienti dal polline che raccolgono e conservare in alveare come beebread. Abbiamo sviluppato metodi per controllare la fonte di polline che le api raccolgono e convertono beebread mettendo colonie in una zona chiusa volo appositamente costruito. I metodi sono stati sviluppati per analizzare le proteine ​​e aminoacidi composizione acida del polline e pappa reale di api. Descriviamo inoltre come il consumo del beebread è stata misurata e metodi utilizzati per determinare operaie adulte titoli proteine ​​ape emolinfa dopo nutrendosi di beebread per 4, 7 e 11 giorni dopo la nascita. I metodi sono stati applicati per determinare se il genotipo riguarda la conversione di polline beebread e il tasso api consumano e acquisiscono proteina da esso. Due sottospecie (api mellifere europee e africanizzate, EHB e AHB rispettivamente) sono stati forniti con la stessa fonte di polline. Sulla base dei metodi sviluppati, beebread fatta da entrambe le sottospecie aveva concentrazioni di proteine ​​più bassi e valori di pH che il polline. In generale, ammino con acidocentrazioni in beebread prese dal EHB o AHB erano simili e si sono verificate a livelli superiori a beebread che nel polline. Sia AHB e EHB consumato significativamente più del beebread fatta da AHB che da EHB. Sebbene EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread, concentrazioni di proteine ​​emolinfa in AHB erano superiori a EHB. Le differenze di acquisizione delle proteine ​​tra AHB e EHB potrebbero riflettere adattamenti ambientali legati alla regione geografica dove ogni sottospecie si sono evoluti. Queste differenze potrebbero contribuire alla creazione di successo delle popolazioni AHB nel Nuovo Mondo a causa degli effetti sulla covata allevamento e la crescita delle colonie.

<html> Beebread stato immagazzinato nel -80 ° C per meno di un mese prima di essere analizzati per pH e la concentrazione di proteine, e per circa 4 mesi prima analisi degli aminoacidi. Beebread differiva dal polline in pH e concentrazione di proteine ​​(Figura 1). Il pH beebread era inferiore al polline era la concentrazione di proteine. Sia EHB e AHB consumato più ABB di EBB (Figura 2). I livelli di proteina solubile nel emolinfa di AHB erano significativamente superiori EHB indipendentemente dal tipo di beebread hanno consumato (figura 3). Queste differenze nei livelli di proteina emolinfa si sono verificati anche se EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread. L&#39;età delle api al momento del campionamento influenzato significativamente le concentrazioni di proteine ​​solubili nel emolinfa. Le concentrazioni di proteine ​​erano significativamente più bassi in day-4 api rispetto al giorno 7 o 11 che non differiscono. _content &quot;&gt; Dei 10 amminoacidi che sono essenziali per api, tutti tranne istidina sono stati rilevati nel polline. Nella maggior parte dei casi, le concentrazioni di aminoacidi misurate in beebread erano superiori nel polline (figura 4). Per esempio, le concentrazioni di leucina e treonina erano superiori di circa il 60% in beebread rispetto al polline, e valina concentrazioni erano superiori di circa il 25%. alanina, acido livelli, glutammina, metionina e aspartico anche erano superiori in beebread che nel polline. concentrazioni Aminoacidi non differiscono notevolmente tra ABB e EBB con l&#39;eccezione di fenilalanina e cisteina. livelli di fenilalanina erano circa il doppio in ABB rispetto sia con EBB o polline. Le concentrazioni cisteina erano inferiori in EBB rispetto a ABB o polline. triptofano era l&#39;unico aminoacido presente in concentrazioni più elevate in polline che in EBB o ABB. Le concentrazioni di prolina in polline e ABB erano superiori in EBB. Figura 1: Confronti di pH (A) e le concentrazioni di proteine ​​solubili (B) nel polline e pappa reale di api da parte europea (EHB) o Africanized (AHB) api. Il pH di polline era significativamente superiore alla beebread come determinato mediante analisi della varianza (F 2,12 = 3725, p &lt;0,0001) seguito da un test di confronto multiplo Tukeys W-. La concentrazione di proteine ​​nel polline era significativamente più alta rispetto a beebread fatta da EHB (EBB) o AHB (ABB) (F = 2,27 16.49; p &lt;0.0001). Mezzi seguiti dalla stessa lettera non sono significativamente differenti al livello 0,05. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: La percentuale media di cells contenenti beebread che sono state completamente consumato in un intervallo 11 giorni dalle api in gabbia. La beebread è stata fatta da uno europeo (EHB) o Africanized (AHB) le api utilizzano la stessa sorgente di polline. Mezzi sono stati stimati da cinque gabbie di ogni trattamento; quelli con la stessa lettera non sono significativamente differenti al livello 0,05 come determinato da un&#39;analisi uno della varianza (F 3,16 = 7.3, p = 0,003) e W test di Tukey. Questa figura è stata modificata da 25. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: la concentrazione media di proteine ​​in emolinfa da europeo (EHB) o Africanized (AHB) api mellifere beebread alimentato fatta da africanizzate (ABB) api europeo (EBB) o per 4, 7, e 11 giorni Una analisi ripetute misure di. varianza ha indicato differenze significative tra il 4 treagruppi TIMENTO (F 3,20 = 19,7, p &lt;0.001). I livelli di proteina solubile in AHB fed ABB erano significativamente superiori a EHB fed ABB (p = 0.008) o EBB (p = 0,018). L&#39;età delle api al momento del campionamento influenzato significativamente le concentrazioni di proteine ​​solubili nel emolinfa. Livelli erano significativamente più bassi in day-4 api rispetto ai giorni-7 (p &lt;0,0001) o 11 (p = 0.001). Giorno 7 e Day11 api non differivano (p = 0,149). Questa cifra è stata modificata da 25. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Concentrazioni di aminoacidi (mcg per grammo di polline o beebread) nel polline o beebread fatta da esso EBB è beebread fatta dalle api europee e ABB è stata fatta dalle api africanizzate. Triptofano, cisteina, fenilalanina e prolina sono state tracciate separatamente a fini di chiarezza in presentano loro quantità. Questa cifra è stata modificata da 25.

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Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

methods-for-comparing-nutrients-beebread-made-africanized-european

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  USDA-ARS. Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies. 

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Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Ricerca

Ambiente

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Valutare l&#39;effetto delle sostanze chimiche ambientali su Honey Bee sviluppo dall&#39;individuo alla colonia Livello

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In Vitro Allevamento di api solitarie: uno strumento per valutare i fattori di rischio larvale

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired glands that are located in the head of the bee are highly sensitive to the quantity and quality of pollen and pollen substitutes that the nurse bee consumes. The glands get smaller when nurses are fed deficient diets and are large when they are fed complete diets. Because nurse hypopharyngeal gland size is a robust indicator of nurse nutrition, it is essential that those studying honey bee nutrition know how to measure these glands. Here, we provide detailed methods for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal glands. We present comparisons of unstained and stained tissue and data that were used to study the impact of pollen on gland size. This method has been used to test how diet impacts hypopharyngeal gland size but has further use for understanding the role of these glands in hive health.

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Hypopharyngeal gland acinus size is a robust measure of nurse honey bee nutrition. Here, we provide a detailed protocol for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal gland acini.

Formato di Acinus ghiandola Hypopharyngeal misurazione in lavoratori ape del miele (mellifera di Apis)

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Neuroscienze

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Biologia

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinato di nucleotidi e proteina estrazioni in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

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Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

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