Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nutrizione delle api mel honey, sul legame tra cattiva alimentazione e crescita e sviluppo della ghiandola ipofaringea. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si può usare per macchiare, visualizzare e misurare facilmente le ghiandole ipofaringee delle ape. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché le ghiandole ipofaringee possono essere difficili da individuare e sezionare senza guida visiva.
Prima di iniziare la procedura, versare la cera di impostazione fredda fusa in una piastra di Petri di vetro. Aggiungere 20 microlitri di macchia di Giemsa appena preparata in un unico pozzo e da 50 a 100 microlitri di soluzione salina in un pozzo adiacente di uno scivolo al microscopio, per ape operaia da elaborare. Quando la cera si è impostata, utilizzare forbici a micro spring da 10 millimetri per rimuovere la testa dalla prima ape e utilizzare le forcep, un microscopio sezionato e una penna da intaglio di cera per incorporare la testa frontale nella piastra di dissezione della cera.
Inserire perni negli occhi e nella bocca per fissare la testa al piatto e utilizzare una lama affilata e rompibile fissata in una morsa perno per fare un'incisione da due a tre millimetri tra gli occhi e le mandibole su ciascun lato della piastra facciale. Eseguire delicatamente le micro forbici sotto la piastra facciale e tagliare il nervo antennale che corre tra l'antenna e il cervello. Usando pini fini, afferrare la piastra del viso per la bocca e inchiodare il tessuto faccia a faccia in giù alla cera con pini a punta fine e un perno.
Successivamente, pipetta 20 microlitri di PBS sulla sezione aperta della testa. Le ghiandole ipofaringee sembrano una stringa di perle e si trovano sopra il cervello se intatte. Utilizzando forcep a punto super fine, raccogliere delicatamente una delle ghiandole per un'immersione immediata nella macchia di Giemsa sullo scivolo della microscopia.
Dopo cinque minuti di incubazione, trasferire la ghiandola nella piscina di soluzione salina sullo stesso scivolo, tagliando la ghiandola in pezzi più piccoli al microscopio con le micro forbici se necessario. Per misurare le ghiandole, aprire il programma di misurazione per il microscopio luminoso e selezionare l'ingrandimento 10 volte superiore. Posizionare lo scivolo sullo stadio del microscopio e individuare manualmente le ghiandole attraverso l'oculare.
Aumentare l'ingrandimento a 60-80 volte e regolare manualmente la messa a fuoco delle ghiandole al nuovo ingrandimento. Regola ulteriormente lo stato attivo delle ghiandole sull'immagine dal vivo sul monitor e inserisci il nome dell'immagine e la descrizione del campione nella casella del nome dell'immagine. Fate clic su Acquisisci immagine (Acquire Image) per ottenere un'immagine delle ghiandole e nella scheda Analisi (Analysis), selezionate lo strumento Area e deselezionate Valore (Value) in Schede visualizzazione (Display).
Anche l'unità non sarà selezionata. Impostare tutte le altre impostazioni su default. Per misurare gli acini, fare clic o tenere premuto continuamente il pulsante sinistro del mouse tracciando un perimetro di acinus alla volta nel modo più attento possibile.
Una volta misurati tutti gli acini di una singola immagine, selezionare Crea report, confermando che sono selezionate le opzioni appropriate, quindi fare clic su Esporta. Quindi salvare il report in un formato adatto e ripulire l'area di lavoro e i materiali in base alle esigenze. È difficile trovare un contrasto adeguato e bordi definiti degli acini nei tessuti non macchiati.
Nelle ghiandole ipofaringee colorate, i bordi degli acini sono affilati a causa del miglioramento del contrasto tra il tessuto colorato e lo sfondo bianco. Le ghiandole ipofaringee crescono nel tempo nelle api che vengono alimentate con miele mescolato con polline, rispetto alle api che vengono alimentate solo con miele. Anche la dimensione della ghiandola ipofaringea è sensibile al tipo di polline fornito.
Ad esempio, le api nutrite con deserto o polline di mandorle dimostrano ghiandole di dimensioni equivalenti, mentre le api nutrite con diete di polline sud-orientali mostrano ghiandole più grandi del miele da sole nutrite con api, ma più piccole delle ghiandole delle api nutrite con mandorla o polline del deserto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sezionare attentamente le ghiandole e di non macchiarle troppo o sotto-macchia. Non dimenticare che lavorare con la macchia di Giemsa può essere pericoloso e che le precauzioni, come tenere la macchia lontana dalle fiamme, utilizzare lo smaltimento corretto e indossare guanti e protezione degli occhi dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
