L'utilizzo di questo protocollo per rimuovere la variazione intercampioni può offrire approfondimenti sulla regolazione differenziale delle macromolecole basate sulle discrepanze intra-campione tra mRNA e livelli proteici. L'uso dello stesso campione per isolare DNA, RNA e proteine è un tentativo di ridurre la variabilità, migliorare la riproducibilità e facilitare l'interpretazione. I vantaggi includono il tempo e le risorse risparmiati al momento della raccolta dei campioni e l'analisi trasversale di campioni preziosi e limitati.
Per iniziare, semina 1.000 uova di verme in un piatto di 10 centimetri con condizioni di crescita appropriate. Incubare a 20 gradi Celsius per 72 ore. Quindi, lavare il piatto con 5 millilitri di tampone M9 e trasferire 1.000 vermi adulti in un tubo.
Centrifugare i vermi a 1.000 g per un minuto, scartare il supernatante e trasferire i vermi pelletati, con un millilitro di tampone M9, in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Centrifuga di nuovo a 845 g per un minuto e scarta la maggior parte del supernatante. Conservare i vermi pelletati a meno 80 gradi Celsius per più di quattro ore.
Quindi, rimuovere qualsiasi supernatante dal pellet scongelato. Aggiungere un millilitro di reagente GTCP freddo, mescolare bene pipettando su e giù e posizionare il campione sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio freddo.
Agitare vigorosamente il tubo per 15 secondi e lasciarlo a temperatura ambiente per tre minuti. Quindi, centrifuga il tubo a 13.500 g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Con una micro-pipetta, trasferire lo strato superiore trasparente in un nuovo tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri privo di RNasi.
Trasferire lo strato nuvoloso di interfase bianca su un nuovo tubo etichettato B2 e trasferire lo strato rosa, dal pellet rimanente, in un nuovo tubo etichettato B e posizionarlo entrambi sul ghiaccio. Separare chiaramente i tre strati può essere difficile. Consiglio di trasferire lo strato nuvoloso interfase nel proprio tubo piuttosto che far precipitare il DNA da questo strato dallo strato organico, o rosa.
Per isolare l'RNA, aggiungere prima 500 microlitri del 100% di isopropanolo al tubo A per far precipitare l'RNA. Quindi, incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo a 13.500 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Successivamente, scartare il supernatante e aggiungere un millilitro di 75% di etanolo al tubo A per lavare il pellet. Centrifugare il tubo a 5.300 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e lasciare asciugare l'aria del pellet per cinque o 10 minuti.
Aggiungere 50 microlitri di acqua priva di RNasi per ricostituire il pellet di RNA e incubare il pellet a 55-60 gradi Celsius per 10 minuti per scioglierlo. Infine, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione dell'RNA isolato a 260 nanometri e per identificare eventuali impurità a 230 e 280 nanometri. Per isolare il DNA, aggiungere prima 300 microlitri di etanolo al 100% alla fase organica nel tubo B e allo strato bianco torbido nel tubo B2 per far precipitare il DNA, mescolare per inversione e lasciare i tubi a temperatura ambiente per due o tre minuti.
Quindi, tubi di centrifuga B e B2 a 376 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellet DNA. Unire il supernatante dei tubi B e B2 in un nuovo tubo a due millilitri etichettato C e lasciarlo sul ghiaccio per il successivo isolamento proteico. Successivamente, lavare il pellet di DNA nel tubo B2 con un millilitro di 0,1 citrato di sodio molare nel 10%etanolo per 30 minuti.
Tubo di centrifuga B2 a 376 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Ripetere il passaggio di lavaggio e quindi sospendere di nuovo il pellet in 1,5 millilitri di etanolo al 75% e lasciarlo a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, centrifugare il tubo B2 a 376 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il supernatante e lasciare asciugare il pellet per cinque-10 minuti.
Sciogliere il pellet in 150 microlitri di idrossido di sodio da otto millilitri. Quindi, centrifugare il campione a 376 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Infine, con una micropipetta, trasferire il supernatante contenente il DNA in un nuovo tubo.
Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione del DNA isolato a 260 nanometri e per identificare eventuali impurità a 230 e 280 nanometri. Per far precipitare la proteina, aggiungere prima fino a 1,5 millilitri di isopropanolo al supernatante rosa nel tubo C, mescolare invertendo più volte e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, tubo di centrifuga C a 13.500 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il supernatante e lavare il pellet con due millilitri di cloridrato di guanidina molare 0,3 nel 95% di etanolo per 20 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare nuovamente il tubo a 5.300 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e ripetere il passaggio di lavaggio come prima. Trasferire il pellet proteico in un nuovo tubo da 1,5 millilitri etichettato C2 e aggiungere fino a 1,5 millilitri di etanolo, vortice e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Centrifugare il tubo a 5.300 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, sciogliere il pellet in 300 microlitri di 5%SDS a 50 gradi Celsius per 60 minuti.
Infine, centrifugare il tubo a 13.500 g a 17 gradi Celsius per 10 minuti. E trasferire il supernatante contenente la proteina in un nuovo tubo. Per eseguire una PCR quantitativa di trascrizione inversa.
In primo luogo, utilizzare un nanogramma dell'RNA isolato per preparare il cDNA mediante trascrizione inversa. Per realizzare una piastra di serie di cDNA, aggiungere 100 microlitri di una o 100 diluizioni di ciascun campione di cDNA ai singoli pozzi di una piastra di 96 pozzi, includere controlli appropriati, come pozzi solo acqua e campioni diluiti in serie, per stabilire l'efficienza del primer per ogni gene. Per creare un mix principale per ogni set di primer, aggiungere fino a sette microlitri di acqua, un colorante al cianuro che intercala il DNA e cinque micromolari ciascuno di primer avanti e indietro.
Aggiungere sette microlitri del mix master ai pozzi appropriati di una piastra RT-qPCR. Quindi, aggiungere tre microlitri del cDNA dalla piastra di serie ed eseguire la piastra utilizzando un protocollo RT-qPCR adatto ai primer utilizzati. L'analisi RT-qPCR di mRNA isolati da quattro campioni indipendenti di tre ceppi di vermi è stata fatta per confermare gli obiettivi identificati dal test seq dell'RNA.
Il gene F07C4.12 è stato upregolato in entrambi i test nei vermi eat-2, ma la sua upregulation nei vermi rsks-1 non è stata rilevata dal saggio RT-qPCR. Inoltre, RNA seq ha rilevato cambiamenti di espressione di mrp-1 nei vermi eat-2 e rsks-1 sono stati confermati tramite RT-qPCR. L'upregolazione o la down-regulation dei geni marcatori organelle nei vermi mutanti sono stati rilevati anche dall'analisi RT-qPCR.
Il confronto tra gtcp e proteine estratte da RIPA nei vermi separati dalla pagina SDS e macchiati di blu coomassie ha mostrato una qualità simile con una migliore risoluzione di proteine più grandi per le proteine estratte da GTCp. L'analisi western delle macchie ha mostrato livelli proteici simili nella maggior parte dei casi;tuttavia, le proteine superiori a 75 kilodalton hanno mostrato livelli inferiori nella proteina estratta da RIPA. Il confronto tra i livelli di mRNA e proteine di quattro singoli campioni di tre ceppi di vermi ha mostrato una bassa variabilità dei livelli di mRNA con una maggiore variabilità a livello proteico.
Nel contesto dell'isolamento del DNA, la resa dipende fortemente dalla competenza a recuperare lo strato nuvoloso interfase dallo strato organico, o rosa. Per migliorare la solubilizzazione delle proteine dal pellet può essere necessario aumentare il volume del tampone di risolubilizzazione o aggiungere altri detergenti oltre all'SDS. L'uso di questo metodo può aiutare a identificare correttamente i casi in cui la traduzione dell'mRNA in proteina non è corelativa e può portare a indagini più approfondite sui meccanismi normativi post-trascrizionali e post-traslazionali in varie condizioni.
Nel nostro laboratorio, questo protocollo è stato utilizzato per conservare campioni core di tempo prezioso e limitato. Inoltre, posso immaginare che questo sarebbe un protocollo utile da adottare nel campo del ritmo circadiano. Il reagente GCTP e i solventi utilizzati nell'isolamento dell'RNA sono pericoli e devono essere usati con cautela.
