Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Science Foundation tedesco (DFG, Ro2327 / 6-1) al CRR Gli autori desiderano ringraziare S. Durry e C. Roderigo per l&#39;assistenza tecnica di esperti, e M. Dubbert (Laboratorio di Elettronica, Zoological Institute , Università di Colonia, Germania) per l&#39;aiuto nella realizzazione del controllore di cella di Pockels e l&#39;interruttore HF.

<ol>
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Gli autori dichiarano senza interessi in competizione. Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario che consenta di pubblicazione Open Access da Rapp optoelettronico (Wedel, Germania), che produce uno strumento utilizzato in questo articolo il video. La società è stata né coinvolta negli esperimenti, né nella gestione dei dati, né nella scrittura manoscritto.

Il presente studio dimostra che SBFI è adatto per due fotoni di imaging di transitori di sodio intracellulari in piccoli compartimenti cellulari. Va tenuto presente, tuttavia, che l&#39;efficienza quantica di SBFI è piuttosto bassa 15 e relativi cambiamenti nella concentrazione di sodio è piuttosto piccola con attività fisiologica. Pertanto, la misurazione ad alta risoluzione di transitori Na + nei processi sottili è un compito relativamente noioso, e binning o media di diversi studi può essere necessario per ottenere segnali soddisfacenti. Inoltre, la cinetica di transienti sodio sono sorprendentemente lento, rendendo obbligatoria registrare per periodi di tempo prolungati. Questa osservazione corrisponde a quelle in studi precedenti, in cui il decadimento monoesponenziale dei transitori di sodio in dendriti neuronali e in astrociti è stata caratterizzata da grandi costanti di tempo di decadimento dell&#39;ordine di 10 secondi a temperatura ambiente 1,2,6. Transitori di sodio sembrano quindi esercitare un tempo molto più lento coUrse e molto più grandi costanti di tempo di decadimento rispetto ai transienti di calcio 16. Mettere da parte questi inconvenienti, l&#39;imaging di sodio dimostra di essere un valido strumento per lo studio delle proprietà fisiologiche dei sottodomini neuronali. Ad esempio, l&#39;imaging di sodio può servire per monitorare l&#39;attività sinaptica eccitatoria in o vicino alla sinapsi attive. Poiché il sodio è essenzialmente non tamponato 8,17, transitori sodio attività indotte sono linearmente correlate a una vasta gamma di rilascio di glutammato sinaptico o esogena glutammato applicati. Essi rappresentano quindi indicatori diretti e imparziali di attività glutamatergico neuronale. Inoltre, indicatore di sodio coloranti presentano s &#39;alta K d (di SBFI K d è nel range di 25 mm 1). Anche a concentrazioni relativamente alte di colorante intracellulari utilizzati per raggiungere la luminosità sufficiente (di solito 0,5-1 mM), l&#39;elevato K d &#39;s implica che i coloranti stessi non agiscono come buffer per sodium. Di conseguenza, essi non distorcano l&#39;ampiezza né il tempo corso di transitori di sodio, che è sempre una preoccupazione quando coloranti calcio-sensibili vengono introdotti nelle cellule 18. Si può pertanto ritenere che i segnali rilevati rappresentano una buona misura delle variazioni &quot;reale&quot; in sodio intracellulare. Il loro decorso lento quindi implica che la velocità di diffusione intracellulare del sodio nei neuroni è molto più piccolo di quanto precedentemente ipotizzato 19. Un requisito fondamentale per la corretta esecuzione di esperimenti che riguardano le proprietà di eccitatori vie di trasmissione e afflusso di sodio sinaptiche nelle spine e dendriti è l&#39;induzione di una attivazione veloce e altamente localizzata di strutture post-sinaptici. Questo può essere ottenuta con l&#39;applicazione facile e locale di glutammato o glutammato agonisti nelle immediate vicinanze di una colonna vertebrale o un dendrite dalla fotolisi lampo di composti gabbia. Fotolisi Flash non dama non meccanicamentege il tessuto, è privo di artefatti da movimento ed è ben stabilito per lo studio di questioni connesse (ad esempio la segnalazione di calcio locale). Il diametro dello spot uncaging è stato di 1,5 micron nel piano xy. Uncaging quasi un segnale di sodio spinosi dendrite indotti in entrambe le spine e il dendrite genitore. Considerando che i segnali tendevano ad essere più grande di spine più vicini al posto uncaging, le ampiezze della dendrite genitore e spine più lontano erano ancora piuttosto simili a quelle nelle immediate vicinanze del punto uncaging. Uncaging è stata eseguita per 300 msec durante il quale le correnti interiori aumentate in ampiezza. Glutammato Uncaged avrebbe diffuso nel tessuto durante lo stesso periodo di tempo, l&#39;attivazione di recettori ionotropici del glutammato e afflusso di sodio sulle regioni dendritiche e le spine più lontano dal punto uncaging. Un problema intrinseco che si verifica quando si utilizza un laser UV per fotolisi di composti in gabbia somministrati attraverso la soluzione di balneazione cellulareè &#39;filtraggio interiore&#39;. A causa del tasso di assorbimento elevato della gabbia, la luce UV si attenua fortemente lungo la strada dall&#39;obiettivo al sito di stimolazione 20,21. Un modo pratico per evitare questo è perfusione locale con la gabbia che è limitato solo per il sito di stimolazione, che riduce inoltre la quantità di composto in gabbia necessaria al minimo. Rispetto al uncaging UV scansione laser-mediata, vicino-infrarossi a due fotoni uncaging 22 è spazialmente più precisa, soprattutto perché la precisione della stimolazione aumenta in asse z. D&#39;altra parte, a causa della piccola sezione di gabbie comunemente usati per le lunghezze d&#39;onda più lunghe come impiegati con eccitazione a due fotoni, sia una elevata concentrazione del composto in gabbia o molto elevato, richiedono intensità luminose potenzialmente fototossiche. Inoltre, due fotoni uncaging richiede un investimento molto maggiore nelle attrezzature; tra gli altri, un laser IR supplementare oltre ai componenti ottici richiesti, sono necessari. Sia SBFI e MNI-glutammato sono eccitabili nella gamma di lunghezze d&#39;onda identica. Questo può portare a una interdipendenza involontaria di laser UV uncaging e SBFI o laser per immagini IR e MNI-glutammato, con conseguente sbiancamento della SBFI dal flash uncaging e / o una uncaging continuo di glutammato dal fascio IR. Tuttavia, come mostrato nella Figura 6C, né un lampo UV per sé né la formazione immagine a più fotoni causato tali influenze reciproche nelle nostre condizioni sperimentali. Sistemi UV-in flash simili a quello qui descritto sono utilizzati di routine in molti altri laboratori e possono essere relativamente facilmente incorporati in nessuna microscopio di imaging multi-fotone esistente. Esso offre il vantaggio che il fascio laser per fotolisi può essere posizionato liberamente nel campo visivo. Inoltre, il sistema permette un riposizionamento rapido ed automatico del fascio laser e il volume di rilascio, rispettivamente, nel campo visivo durante un esperimento. Oumodifica r semplifica e migliora il posizionamento accurato dello spot uncaging, in modo che i frame del software di imaging possono servire per regolare fotogrammi di imaging e uncaging congruente. Nel loro insieme, whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in dendriti e spine dei neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging UV-luce-indotta di glutammato, permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. Si può quindi servire per analizzare le proprietà di trasmissione sinaptica eccitatoria e segnali di sodio nei neuroni postsinaptici nel tessuto intatto.

Recenti miglioramenti nelle tecniche microscopiche leggeri quali microscopia multi-fotone hanno consentito lo studio dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, queste tecniche sono ora ampiamente utilizzati per analizzare i segnali elettrici di attività legate sui neuroni e segnali di calcio concomitanti in piccoli compartimenti subcellulari, vale a dire in dendriti sottili e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio in dendriti e spine, le cui proprietà sono in gran parte inesplorate. Tali segnali possono essere analizzati da due fotoni di imaging di sodio intracellulare ([Na +] i) che permette la misurazione on-line di [Na +] i transienti per periodi prolungati senza significativo sbiancamento colorante o foto-danno 1,2. Per l&#39;imaging di i [Na +] </sub&gt;, a pochi coloranti indicatore chimico sono disponibili, ad esempio Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente più comunemente usato per Na + imaging è sodio-binding isoftalato benzofuran (SBFI). Si tratta di un raziometrica, colorante UV-eccitato simile al noto colorante calcio-sensibile fura-2 ed è stato impiegato per l&#39;imaging convenzionale Na + in molti tipi di cellule (ad esempio 5,6). Ci sono diverse possibilità di emozionanti del colorante e raccogliendo sua fluorescenza. Se è richiesta alta risoluzione temporale (cioè un frame rate elevato di imaging) in combinazione con le informazioni spaziali, SBFI può essere eccitato con una lampada allo xeno ad arco o un diodo dispositivo ad alta potenza di uscita della luce (LED) e la sua emissione rilevato con una carica ad alta velocità Dispositivo -coupled (CCD), fotocamera 7,8. Per la risoluzione spaziale massima profondità nel tessuto, microscopia a scansione laser multi-fotone è il metodo di scelta 9. Il relativamente basso efficie quantisticaNCY di SBFI richiede concentrazioni relativamente alte di colorante (0,5-2 mm), e il caricamento diretto del modulo membrana impermeabile di SBFI tramite un forte microelettrodo 10 o la patch pipetta 1. Utilizzando SBFI, precedenti lavori eseguiti in fettine di tessuto acute dell&#39;ippocampo roditori hanno dimostrato attività legate transitori di sodio in dendriti e spine dei neuroni CA1 piramidali che sono causati principalmente da afflusso di sodio attraverso ionotropici NMDA recettori 1,2. Per lo studio delle proprietà di tali segnali sodio locali in maggior dettaglio, l&#39;attivazione di specifici recettori postsinaptici di applicazione di agonisti del recettore è un metodo adatto di scelta. Per simulare l&#39;attività presinaptica e rilascio del trasmettitore, l&#39;applicazione dovrebbe essere relativamente breve e focalizzato per consentire la stimolazione locale. Questo, tuttavia, risulta essere molto impegnativo nel tessuto intatto. Applicazione di pressione locale di agonisti del recettore con una pipetta a punta fine permette di ap molto focaleplicatura, ma ospita il rischio potenziale per produrre il movimento della struttura di interesse (ad esempio, come un dendrite o spine dendritiche), e quindi ostacola imaging ad alta risoluzione. L&#39;idoneità di ionoforesi di sostanze neuro-attivi dipende dalle loro proprietà elettriche e alte ampiezze di corrente può produrre artefatti cellulari pure. Un modo per aggirare questi ostacoli è l&#39;impiego di composti foto-attivati ​​e la loro fotolisi del flash. Fondamentalmente, due principi differenti vengono utilizzati per la foto-attivazione di sostanze in gabbia: I) a largo campo del flash fotolisi 11 e II) uncaging focale impiegando moduli di scansione in combinazione con il laser 12. Mentre in tutto il campo del flash fotolisi viene utilizzato per attivare più grandi regioni di interesse, ad esempio, un intera cella, uncaging focale è impiegata per stimolare in particolare i piccoli compartimenti cellulari. In questo studio dimostriamo una procedura per whole-cell patch-clamp e multi-pImaging sodio Hoton in dendriti e spine di neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging luce UV-indotta di glutammato, che permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto.

<table><tbody><tr><td>Borosilicate-glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC compatible camera</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Miniature fiber optic spectrometer</td></tr><tr><td>Filter tubes</td><td>VWR</td><td></td><td>cenrifugal filter, 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>IR beam power controller</td><td>Custom built</td><td></td><td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td></tr><tr><td>IR laser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION</td></tr><tr><td>IR power monitor</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope/Imaging System</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td></tr><tr><td>ND filter wheel</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Narishige</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic drug ejection system</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Pockels cell</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td></tr><tr><td>Pockels cell driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>High voltage differential amplifier</td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-coated BeCu blades</td></tr><tr><td>Shutter controller</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Uncaging software</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td></tr><tr><td>UV laser scanning system</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Galvanometric scanning system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Compound&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/&lt;br /&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>SBFI K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Caged glutamate released upon UV absobtion</td></tr></tbody></table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Multi-fotone microscopia a fluorescenza ha permesso l&#39;analisi dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, è ampiamente usato per studiare i segnali di calcio di attività legate in piccoli compartimenti subcellulari come i dendriti e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio post-sinaptici, le cui proprietà sono solo marginalmente comprensibili. Qui, descriviamo un metodo per combinato whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in micro domini cellulari dei neuroni centrali. Inoltre, si introduce una procedura modificata per l&#39;ultra-violetta (UV) uncaging-luce-indotta di glutammato, che consente l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. A tal fine, le registrazioni cellule intere sono state effettuate su Cornu Ammonis suddivisione 1 (CA1) neuroni piramidali in fettine di tessuto acute dellaippocampo di topo. I neuroni sono stati riempiti con il sodio-sensibile colorante fluorescente SBFI attraverso la patch-pipetta, e multi-fotone di eccitazione del SBFI consentito la visualizzazione dei dendriti e spine adiacenti. Per stabilire uncaging focale indotta da UV, diversi parametri tra cui l&#39;intensità della luce, volume interessato dal fascio uncaging UV, posizionamento del fascio così come la concentrazione del composto in gabbia sono stati testati e ottimizzati. I nostri risultati mostrano che la perfusione locale con glutammato in gabbia (MNI-glutammato) e il suo risultato UV-uncaging focale nelle correnti interiori e transitori di sodio in dendriti e spine. Naturalmente il tempo e l&#39;ampiezza delle due correnti attivo e segnali sodio correlano con la durata dell&#39;impulso uncaging. Inoltre, i nostri risultati mostrano che i segnali di sodio intracellulari sono bloccati in presenza di bloccanti per i recettori ionotropici del glutammato, dimostrando che essi sono mediati da afflusso di sodio se questo percorso. In sintesi, il nostro metodo fornisce uno strumento affidabile per laricerca di segnali di sodio intracellulari indotti da attivazione del recettore focale nel tessuto cerebrale intatto.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato una procedura per la microscopia multi-fotone delle dinamiche di sodio cellulari con il colorante fluorescente SBFI sodio-dipendenti nei neuroni piramidali CA1 di topo acuta fettine di tessuto ippocampale. Inoltre, mostriamo come combinare questa tecnica di imaging con uncaging a base di laser-scanning di composti neuro-attiva (ad esempio glutammato in gabbia) e la sua precisione di targeting per cellulari micro-domini. Caricamento neuroni con SBFI attraverso la patch-pipetta permesso la visualizzazione di tutta la cellula compresi dendriti e spine sottili adiacenti impiegando multi-fotone di eccitazione (Figura 6A, B, D e Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 segnali di sodio e correnti sinaptiche indotte dal flash fotolisi del glutammato in gabbia. (A) MaximAl proiezione dell&#39;immagine di un neurone piramidale CA1 caricato con SBFI tramite la pipetta di patch (PP). La casella indica l&#39;area indicata ampliata nel B. LP indica la posizione e l&#39;orientamento della pipetta per perfusione locale di glutammato in gabbia. (B) ad alta potenza massima proiezione di una pila di sezioni ottiche di un dendrite con spine dendritiche adiacenti. Le pile di sezioni ottiche sottoposti z-allineamento e deconvoluzione. La croce rossa indica la regione di destinazione del fascio uncaging. La linea tratteggiata arancione delimita la regione di interesse da cui è stata registrata l&#39;emissione di fluorescenza. La casella indica l&#39;area indicata ampliata nel D. (C) A sinistra: il segnale di sodio (riga superiore) e somatica verso l&#39;interno di corrente (riga inferiore) indotta dal flash fotolisi del glutammato in gabbia (indicato dal lampo giallo). La linea rossa rappresenta un fit dei dati sperimentali. L&#39;area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300msec) ostruito l&#39;imaging di fluorescenza SBFI Destra:. senza pre-perfusione con glutammato in gabbia, la stessa UV-flash né evocato un cambiamento di emissione SBFI, né una corrente verso l&#39;interno (D) A sinistra:. Immagine ad alta potenza del dendrite e adiacente spine come delineata in B. Accanto, la stessa immagine con valori di grigio invertite. Le linee tratteggiate indicano le regioni di interesse in cui è stato registrato l&#39;emissione di fluorescenza. La croce rossa indica la localizzazione del fascio uncaging Destra:. Transienti sodio indotta da UV-flash fotolisi del glutammato in gabbia. Blu traccia: segnali di sodio nel dendrite; traccia rossa: risposta media da tre spine adiacenti al punto uncaging; traccia verde: risposta media da tre spine lontane. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la perfusione locale con Cagedglutammato, applicando un UV-flash vicino ad un dendrite portato ad una diminuzione transitoria emissione di fluorescenza di SBFI, riflettendo un aumento della concentrazione di sodio intracellulare (Figura 6C, D e Figura 7B). Allo stesso tempo, una corrente verso l&#39;interno è stato registrato al soma (Figura 6C e Figura 7B). Aumentare la durata del flash UV ha portato ad aumentare ampiezze sia della suscitato verso l&#39;interno correnti e segnali di sodio (dati non mostrati), indicando che il sistema era ben all&#39;interno della sua gamma dinamica e che le risposte non uncaging né cellulari erano saturi. Applicazione di un UV-lampo di identica durata o più per sezioni che non sono state pre-perfusi con glutammato in gabbia, non ha provocato cambiamenti nel SBFI fluorescenza né correnti interiori, indicando che questi segnali sono dovuti alla uncaging di glutammato (Figura 6C). Inoltre, questi risultati mostrano che nessuna interdipendenza dei componenti imaging- e uncaging si osserva under nostre condizioni sperimentali. Segnali di sodio potrebbe essere rilevato anche in spine dendritiche (Figura 6D). Anche se non abbiamo tentato di ottenere la stimolazione di un singolo colonna vertebrale solo con glutammato uncaging, ampiezze di picco tendevano ad essere leggermente superiore a spine vicino al punto uncaging, considerando spine più lontano hanno mostrato variazioni di fluorescenza praticamente identiche come il dendrite genitore (Figura 6D). Infine, abbiamo studiato il percorso per afflusso di sodio nei dendriti e spine in risposta a uncaging di glutammato. A tal fine, abbiamo impiegato CNQX e APV, che sono bloccanti selettivi per i sodio-permeabili, recettori ionotropici del glutammato del AMPA- e NMDA-sottotipo, rispettivamente. I nostri risultati mostrano che i segnali sodio intracellulare indotta da glutammato e le correnti somatici stimolate sono stati omessi in presenza di questi bloccanti (Figura 7B). Al momento del wash-out dei bloccanti, i segnali sono riacquistato. Questo dimostra that uncaging di glutammato attiva i recettori del glutammato ionotropici sui neuroni piramidali CA1, che mediano l&#39;afflusso di sodio nei dendriti e spine, con conseguente transienti intracellulari di sodio e correnti verso l&#39;interno. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7 profilo farmacologico dei segnali di sodio evocate e delle correnti verso l&#39;interno. (A) SBFI pieno CA1 piramidale neuroni con la patch pipetta (PP) allegato al soma (B) A sinistra:. Transitorio di sodio e la corrente somatica indotta da foto-attivazione di glutammato in gabbia in un dendrite e spine collegate Center. Perfusione con l&#39; ionotropici bloccanti del recettore del glutammato CNQX e APV inibisce sia il segnale di sodio e la corrente verso l&#39;interno indotta da uncaging destra:. Su wash-out dei bloccanti, i segnali vengono ripristinati. I rappre linea rossats una misura dei dati sperimentali. L&#39;area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300 msec) ostruito l&#39;imaging di fluorescenza SBFI. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Views.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo. 

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

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Neuroscienze

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantificare i flussispontanei di Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...