이 연구는 저자는 S. Durry와 C. 로드리고 전문 기술 지원, 그리고 M. Dübbert (전자 공학 연구소, 동물학 연구소 감사드립니다 CRR하는 독일 과학 재단 (DFG, Ro2327 / 6-1)의 연구비 지원 포켈 셀 컨트롤러와 HF 스위치를 구현하는 데 필요한 지원을위한 쾰른, 대학, 독일).

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. 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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다. 저자는 비디오 문서에서 사용되는 악기를 생산 라프 광전자 (베델, 독일)에 의해 오픈 액세스 출판을 가능하게 재정 지원을 받았다. 이 회사는 실험이나 데이터를 처리하거나 원고 작성에 참여도했다.

본 연구는 SBFI 작은 세포의 세포 내 구획 나트륨 과도 이광자 촬상에 적합하다 보여준다. 그것은 SBFI의 양자 효율은 나트륨 농도가 다소 낮은 15 상대적인 변화가 생리 활성을 갖는 아주 작은이라는 점을 명심해야한다. 따라서, 미세 공정에서 나트륨 + 과도 고분해능 측정이 비교적 지루한 작업이며, 여러 가지 실험의 비닝 (binning) 또는 평균화 양호한 신호를 얻을 필요가있다. 또한, 나트륨 과도 동력학 확장 된 시간 기간에 대해 기록하는 것이 의무화 놀랍게도 느리다. 이러한 관찰은 신경 돌기 교세포와 나트륨 과도 단지 수 붕괴 실온 1,2,6에서 10 초의 범위에서 큰 감쇠 시간 상수에 의해 특성화 된 곳 이전 연구에서 이들에 대응한다. 나트륨 과도 따라서 훨씬 느린 시간 협력을 발휘하는 것urse 칼슘 과도 (16)에 비해 훨씬 더 큰 감쇠 시상수. 이러한 단점을 따로 설정, 나트륨 이미징은 신경 세포의 하위 도메인의 생리 학적 특성 조사를위한 유용한 도구가 될 증명한다. 예를 들어, 나트륨 이미징 또는 가까운 활성 시냅스에 흥분성 시냅스 활동을 감시하는 역할을 할 수 있습니다. 나트륨은 본질적으로 8, 17 버퍼링되지 않으므로, 활성 유도 나트륨 과도 선형 시냅스 글루타메이트 방출 다양한 관련 또는 외생 글루타메이트를 적용한다. 그들은 따라서 신경 세포의 글루타메이트 활동의 직접적이고 공정한 지표를 나타냅니다. 또한, 나트륨 인디케이터 염료는 높은 K D의 집 (SBFI의 K (D)가 25 내지 1 mm의 범위에있다) 나타낸다. (- 1 ㎜ 통상 0.5), K의 높은 D의이 염료 자체가 발을위한 버퍼로서 작용하지 않는 것을 의미하더라도 충분한 휘도를 달성하기 위해 사용되는 상대적으로 높은 세포 농도에서 염료odium. 결과적으로, 그들은 칼슘에 민감한 염료 셀 (18)에 도입 할 때 항상 문제가되는 나트륨 과도 전류의 진폭도 시간 과정을 왜곡하지 않습니다. 따라서 그것은 감​​지 된 신호가 세포 내 나트륨의 &quot;진짜&quot;변화의 좋은 척도를 나타내는 것으로 가정 할 수있다. 그들의 느린 시간 경과 후 뉴런에 대한 세포 내 나트륨 확산 속도는 이전에 19을 가정보다 훨씬 작은 것을 의미한다. 등뼈 및 수지상으로 흥분성 시냅스 전달 나트륨 유입 경로의 특성을 어드레싱 실험 성공적인 실행을위한 중요한 요구 사항은 시냅스 구조를 빠르고 높은 국부 활성화의 유도이다. 이는 척추의 직접 또는 근방 갇힌 화합물의 플래시 광분해 수지상에 글루타메이트 또는 글루타메이트 작용 물질의 신속하고 로컬 애플리케이션에 의해 얻을 수있다. 플래시 광분해하지 기계적 DAMA을 수행GE의 조직, 운동 유물의 무료이며 아니라 관련 질문의 조사를 위해 (예를 들어 지역의 칼슘 신호)를 설립한다. uncaging 스폿의 직경은 XY 평면 내에서 1.5 μM이었다. Uncaging 두 쪽의 가시 덴 드라이트에 의한 나트륨 신호에 가까운 부모 덴 드라이트 (dendrite). 신호 uncaging 스폿에 가장 가까운 쪽의 큰 경향 반면, 상위 덴 드라이트의 진폭과 등뼈가 여전히 멀리 uncaging 스폿의 직접적인 근방에서와 다소 유사 하였다. Uncaging 안쪽 전류 진폭이 증가하는 동안 300 밀리 초 동안 수행 하였다. Uncaged 글루타메이트가 멀어 uncaging 지점에서 수지상 영역과 등뼈에 이온 성 글루타메이트 수용체 나트륨 유입 활성화, 동일 기간 동안 조직에 확산 한 것이다. 셀 입욕 용액을 통해 투여 갇힌 화합물의 광분해를위한 UV 레이저를 사용할 때 발생하는 본질적인 문제&#39;내부 필터링&#39;입니다. 때문에 케이지의 높은 흡수율, UV 광 자극 사이트 (20, 21)로부터 대물 도중에 강하게 감쇠된다. 이를 방지하기 위해 적합한 방법은 또한 최소로 필요한 갇힌 화합물의 양을 감소 자극 사이트로 제한 케이지 로컬 관류이다. UV 레이저 주사 매개 uncaging, 근 적외선 이광자에 비해 uncaging 22 자극 정밀도 z 축으로 증가하기 때문에, 주로, 공간적으로 더 정확하다. 한편, 때문에, 이광자 여기에 채용 높은 갇힌 화합물의 농도 또는 매우 높음 어느 잠재적 광독성 광도 필요할 때 장파장위한 일반적으로 사용되는 케이지 작은 횡단면. 또한, 이광자 uncaging은 장비에 훨씬 더 높은 투자를 필요로한다; 다른 사람의 사이에서, 추가로 IR 레이저 플러스 필요한 광학 부품이 필요하다. SBFI 및 MNI 글루탐산 모두 동일한 파장 범위에서 고르기가있다. 이것은 uncaging 플래시 및 / 또는 IR 빔에 의해 글루타메이트의 연속 uncaging 의해 SBFI의 표백 결과, 레이저 및 UV uncaging SBFI 또는 IR 촬상 레이저 및 MNI-글루타메이트의 의도하지 않은 상호 의존성을 초래할 수있다. 도 6c에 도시 된 바와 같이 단, 어느 쪽도 그 자체 다 광자 촬상 의한 UV 플래시가 우리의 실험 조건 하에서 같은 상호 영향을 발생하지 않는다. 여기에 설명 된 것과 유사한 UV 점멸 시스템은 여러 실험실에서 일상적으로 사용되며, 비교적 용이하게 기존의 다중 광자 현미경 이미징에 혼입 될 수있다. 그것은 광분해 용 레이저 빔이 시야에 자유롭게 배치 될 수있는 장점을 제공한다. 또한, 시스템은 실험 기간 동안 시야에 각​​각 레이저 빔의 빠르고 자동화 재배치 및 박리 볼륨을, 가능하게한다. 오우R 개질 단순화 및 이미징 소프트웨어의 프레임이 복합적 으 이미징 uncaging 프레임들을 조정하는 역할을 할 수 있도록, uncaging 스폿의 정확한 위치 결정을 개선시킨다. 이와 함께, 글루타메이트의 자외선에 의한 uncaging에 대한 수정 절차와 결합 돌기 및 중앙 신경 세포의 등뼈에서 전체 세포 패치 - 클램프 및 다중 광자 나트륨 이미징, 조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 활성화 할 수 있습니다. 따라서 그것은 본래 조직에서 신경 세포에서 흥분성 시냅스 전달 및 시냅스 나트륨 신호의 특성을 분석하는 역할을 할 수있다.

이러한 다중 광자 현미경과 같은 광학 현미경 기술의 최근 개선은 높은 공간 및 시간 해상도로 그대로 조직에서 뇌 세포의 형태 학적 및 생리 학적 파라미터의 연구를 활성화. 전기 생리학과 결합,이 기술은 현재 널리 즉 미세 돌기 및 돌기 쪽의 작은 세포 내 구획에서 신경 세포의 활동과 관련된 전기 신호뿐만 아니라 부수적 인 칼슘 신호를 분석하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 외에도 시냅스 활성 또한 덴 드라이트 및 등뼈 나트륨 신호를 유도의 특성은 크게 비경이다. 이러한 신호는 [나 +] 상당한 염료 표백 또는 광 손상 1,2없이 장기간 제가 과도 온라인 측정을 가능하게 세포 내 나트륨 이광자 영상 ([나 +] I)에 의해 분석 될 수있다. [나 +] 난의 이미징을위한 </&gt; 서브, 단 몇 화학 표시기 염료는, 예를 들어 코로나 녹색 또는 아산테 나트륨 녹색 3,4 사용할 수 있습니다. + 나 촬상 대한 가장 일반적으로 사용되는 형광 프로브는 나트륨 - 결합 벤조 푸란 이소 프탈레이트 (SBFI)를이다. 이것은 잘 알려진 칼슘 민감 염료의 Fura-2와 유사한 비율 적, UV 여기 된 염료이고 (예 5,6)는 많은 세포 유형에서 종래 + 나 촬상을 위해 사용되었다. 흥미로운 염료 및 형광을 수집하는 다른 가능성이 있습니다. 높은 시간 해상도 (즉, 높은 촬상 프레임 레이트), 공간 정보와 함께 필요한 경우 SBFI는 고속 전하 검출 크세논 아크 램프 또는 고출력 발광 다이오드 (LED) 장치 및 그 발광으로 여기 될 수있다 -coupled 소자 (CCD) 카메라 7,8. 깊은 조직에서 최대 공간 해상도를 들어, 다중 광자 레이저 주사 현미경 (9)의 선택 방법이다. 상대적으로 낮은 양자 efficie(- 0.5 mM의 2) 및 날카로운 미세 전극 (10) 또는 패치 피펫 1 비아 SBFI의 불 투과성 멤브레인 형태의 직접 로딩 중 SBFI NCY 염료는 비교적 높은 농도를 필요로한다. SBFI를 사용하여 쥐 해마의 급성 조직 슬라이스에서 수행 초기 연구는 주로 1,2 수용체 이온 성 NMDA을 통해 나트륨의 유입에 의해 발생 CA1 피라미드 뉴런의 수상 돌기 및 등뼈 활동 관련 나트륨 과도를 보여 주었다. 더 자세하게 현지 나트륨 신호의 특성 연구를 위해, 수용체 작용제의인가에 의해 시냅스 수용체의 활성화는 특정 선택의 매우 적합한 방법이다. 시냅스 활동 및 송신기 릴리스를 모방하기 위해, 응용 프로그램은 상대적으로 짧은하고 현지 자극 수 있도록 집중해야한다. 그러나, 이것은 조직 손상에 매우 어려운 것으로 판명. 뾰족한 피펫을 사용하여 수용체 작용제의 현지 압력 응용 프로그램은 매우 초점 AP 통신을 가능하게습곡은 있지만 (예컨대 수지상 또는 돌기 쪽로서 예) 관심있는 구조의 움직임을 제조 위험을 호스팅, 따라서 고해상도의 촬상을 방해. 신경 활성 물질의 이온 토 포레 시스의 적합성은 자신의 전기적 특성에 따라 달라지며 높은 전류 진폭뿐만 아니라 세포 아티팩트를 생성 할 수있다. 이러한 장애물을 회피하는 한 방법은 광 활성 화합물 및 이의 플래시 광분해의 채용이다. 기본적으로, 두 개의 서로 다른 원리가 갇힌 물질의 광 활성화를 위해 사용된다 : 레이저 (12)와 조합하여 스캐닝 모듈을 이용하는 I) 와이드 필드 플래시 광분해 (11) 및 II)의 초점 uncaging. 와이드 필드 플래시 광분해가 큰 관심 영역을 활성화하기 위해 사용되지만, 예를 들면, 전체 셀은 초점 uncaging 특별히 작은 세포질 구획을 자극하기 위해 사용된다. 본 연구에서 우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 다중 페이지를위한 절차를 보여조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 작동되도록 글루타메이트의 자외선에 의한 uncaging에 대한 수정 절차와 결합 돌기 및 중앙 신경 세포의 등뼈에 hoton 나트륨 이미징,.

<table><tbody><tr><td>Borosilicate-glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC compatible camera</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Miniature fiber optic spectrometer</td></tr><tr><td>Filter tubes</td><td>VWR</td><td></td><td>cenrifugal filter, 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>IR beam power controller</td><td>Custom built</td><td></td><td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td></tr><tr><td>IR laser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION</td></tr><tr><td>IR power monitor</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope/Imaging System</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td></tr><tr><td>ND filter wheel</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Narishige</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic drug ejection system</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Pockels cell</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td></tr><tr><td>Pockels cell driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>High voltage differential amplifier</td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-coated BeCu blades</td></tr><tr><td>Shutter controller</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Uncaging software</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td></tr><tr><td>UV laser scanning system</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Galvanometric scanning system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Compound&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/&lt;br /&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>SBFI K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Caged glutamate released upon UV absobtion</td></tr></tbody></table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

다중 광자 형광 현미경은 높은 시공간 해상도의 손상 조직에서 뇌 세포의 형태 학적 및 생리 학적 파라미터들의 분석을 가능하게했다. 전기 생리학과 결합, 그것은 널리 돌기 및 돌기 쪽이 작은 세포 내 구획 활동 관련 칼슘 신호를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 외에도 시냅스 활성은 또한 시냅스 나트륨 신호 미미한 이해되고있는 특성을 유도한다. 여기서는 중앙 신경 세포에 결합 된 미소 영역 전체 세포 패치 - 클램프 및 다중 광자 나트륨 촬상하기위한 방법을 설명한다. 또한, 우리는 조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 작동되도록 자외선 (UV) 글루탐산 - 빛에 의한 uncaging에 대한 수정 절차를 소개합니다. 이를 위해, 전체 셀 녹음 Cornu Ammonis 세분 한 (CA1)의 급성 조직 슬라이스의 피라미드 뉴런에서 수행 하였다마우스 해마. 뉴런은 패치 피펫을 통해 나트륨에 민감한 형광 염료 SBFI 가득하고, SBFI의 다 광자 여기에는 수상 돌기에 인접한 쪽의 시각화를 사용 하였다. UV-유도 된 초점 uncaging을 확립하기 위해, 광량, UV uncaging의 빔에 의해 영향 볼륨 빔의 위치 결정뿐만 아니라, 케이지 화합물의 농도 등 여러 가지 파라미터를 테스트하고 최적화 하였다. 우리의 결과는 갇힌 글루타메이트 (MNI-글루타민산)와 그 지역의 관류와 수상 돌기 및 등뼈의 안쪽으로 전류와 나트륨 과도에서의 초점 UV-uncaging 결과를 보여줍니다. 시간 경과와 내측 전류 나트륨 신호 모두의 진폭은 uncaging 펄스의 지속 기간과 연관. 또한, 우리의 결과는이 통로 비록 나트륨 유입에 의해 매개된다는 보여주는 세포 내 나트륨 이온 성 신호가 글루타메이트 수용체 차단제의 존재 하에서 차단되는 것으로 나타났다. 요약하면, 우리의 방법에 대한 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다뇌 조직 손상에 초점 수용체 활성화에 의해 유도 된 세포 내 나트륨 신호들의 조사.

본 연구에서는 급성 마우스 해마 조직 슬라이스의 CA1 피라미드 뉴런의 나트륨 의존 형광 염료 SBFI와 휴대 나트륨 역학의 다중 광자 현미경을위한 절차를 보여줍니다. 또한, 우리는 신경 활성 화합물의 레이저 스캐닝 기반 uncaging (예 갇힌 글루타메이트) 및 셀룰러 마이크로 도메인 대상의 정확한로이 영상 기술을 결합하는 방법을 보여줍니다. 패치 피펫을 통해 SBFI와로드 신경 미세 돌기 및 다중 광자 여기를 이용하여 인접한 쪽 (그림 6A, B, D 및도 7a)를 포함하여 전체 셀의 시각화를 가능하게했다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> 도 6 나트륨 신호 갇힌 글루타메이트의 플래시 광분해에 의한 시냅스 전류. (A) 맥심패치 피펫 (PP)를 통해 SBFI로드 CA1 피라미드 뉴런의 알 투사 이미지. 상자 B. LP에 확대 도시 된 영역에 갇힌 글루타메이트의 로컬 관류 용 피펫의 위치 및 방위를 나타내는 나타낸다. (B) 인접한 돌기 쪽 함께 덴 드라이트의 광 부분의 스택의 높은 전력 최대 투영. 광학 부분의 스택은 Z-정렬 및 디컨 볼 루션을 시행 하였다. 적십자는 uncaging 빔의 대상 영역을 나타냅니다. 점선은 오렌지 형광 방출이 기록되었던 관심 영역을 묘사한다. (노란색 플래시로 표시)에 갇힌 글루타메이트의 플래시 광분해에 의해 유도 전류 (아래 줄) 안쪽으로 나트륨 신호 (상단 행)와 체세포 : 상자가 왼쪽 D. (C)에 확대 표시 영역을 나타냅니다. 빨간색 선은 실험 데이터의 착용감을 나타냅니다. 회색 영역은 기간을 나타내는 uncaging 플래시 ((300)에갇힌 글루타메이트 미리 관류없이 동일한 UV 플래시하지도 SBFI 방출의 변화,도 내향 전류를 유발 (D) 좌측 :. 밀리 초)은 오른쪽 SBFI 형광의 촬상을 방해하지. 수지상 인접의 고성능 이미지 나란히, B에 묘사로, 반전 회색 값으로 같은 이미지를 등뼈. 점선은 형광 방출이 기록 된 관심의 영역을 나타냅니다. 적십자는 uncaging 빔의 현지화를 나타내는 오른쪽 :. 갇힌 글루타메이트의 UV-플래시 광분해에 의해 유도 된 나트륨 과도. 블루 추적 : 수상 돌기 나트륨 신호; 빨간색 추적 : uncaging 자리에 인접한 세 쪽의 응답을 평균; 녹색 추적 : 세 먼 쪽의 응답을 평균. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 리테이너 타입 로컬 재관류 후글루타메이트, 덴 드라이트에 가까운 UV 섬광을인가하는 세포 내 나트륨 농도 (도 6C, D 및도 7b)의 증가를 반영 SBFI의 형광 발광에서의 일시적인 감소되었습니다. 동시에, 안쪽으로 전류 소마 (도 6C 및도 7b)을 기록 하였다. UV 플래시의 지속 시간을 증가시키는 것은 시스템이 아니라 그것의 동적 범위 내에서 uncaging이나 셀룰러도 응답이 포화되었다는 것을 나타내는, 두 전류와 나트륨 신호 (미도 데이터)를 내측으로 유도의 진폭을 증가되었습니다. 갇힌 글루타메이트 사전 관류되지 않은 조각 동일하거나 더 긴 기간의 UV-플래시의 응용 프로그램이 신호는 글루타메이트의 uncaging (그림 6C)에 의한 것을 나타내는 SBFI 형광이나 안쪽으로 전류의 변화를 유발하지 않습니다. 또한, 이러한 결과는 imaging- 및 uncaging 구성 요소에는 상호 의존성 유 관찰되지 않았 음을 보여우리의 실험 조건 파인더. 나트륨 신호는 돌기 쪽이 (그림 6D)에서 검출 될 수있다. 우리는 단지 글루타메이트 uncaging 단일 척추 자극을 달성하지 못했지만, 피크 진폭 쪽이 더 멀리 부모 덴 드라이트 (그림 6D)로 거의 동일 형광 변화를 보여 주었다 반면, uncaging 지점에 가까운 쪽이 약간 높은 경향을 보였다. 마지막으로, 우리는 글루타메이트의 uncaging에 대한 응답으로 수상 돌기 및 등뼈에 나트륨 유입의 경로를 연구 하였다. 이를 위해, 우리는 각각 AMPA- 및 NMDA-아형의 나트륨 투과성, 이온 성 글루타메이트 수용체에 대한 선택적 차단제이다 CNQX 및 APV를 채용. 우리의 결과는 글루타메이트 - 유도 된 세포 내 나트륨 신호 및 유도 전류 체세포 이러한 차단제 (도 7b)의 존재를 생략되었다는 것을 나타낸다. 차단제의 워시 아웃시, 신호가 회복됩니다. 이 그쪽을 보여줍니다글루타메이트의 t의 uncaging 세포 내 나트륨 과도 안쪽으로 전류의 결과로, 수상 돌기 및 등뼈에 나트륨의 유입을 중재 CA1 피라미드 뉴런에 이온 성 글루타메이트 수용체를 활성화합니다. <img alt="그림 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> 유발 나트륨 신호와 내부 전류의 그림 7 약리 프로필. 소마에 부착 (A) 패치 피펫 (PP)와 SBFI 가득 CA1 피라미드 신경 세포 (B) 왼쪽 :. 나트륨 과도와 수상 돌기에 갇힌 글루타메이트의 사진 활성화에 의해 유도 된 체세포 현재와 연결된 척추 센터 :.와 관류 이온 성 글루타메이트 수용체 차단제 CNQX 및 APV는 나트륨 신호와 uncaging에 의해 유도 된 안쪽으로 현재를 모두 억제 오른쪽 :. 차단제의 워시 아웃시, 신호가 복원됩니다. 빨간색 선 represen실험 데이터의 적합의 TS. 회색 영역은 uncaging 플래시 (300 밀리 초)가 SBFI 형광 이미징을 방해하는 기간을 나타냅니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K 조회수.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다. 

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

연구

신경과학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...