Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio canadese istituti di ricerca sulla salute, scienze naturali e ingegneria ricerca (NSERC Discovery Grant) e la Fondazione di Savoia. OC è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato di ricerca da NSERC.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente agli orientamenti del Comitato di protezione animale Université Laval e del Consiglio canadese su Animal Care sul benessere degli animali.
1. preparazione preliminare (opzionale: preparare 1 giorno in anticipo)
<ol><li>Preparare tre tipi di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) soluzione (normale, saccarosio e soluzioni di recupero, 1L; si veda tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm25 e raffreddare il saccarosio ACSF giù un punto vicino allo zero (0-4 ° C). Nota: L'uso di una soluzione di taglio basso-sodio (ACSF-saccarosio) aiuta a preservare la vitalità dei neuroni negli strati superficiali di fettine acute26.</li>
	<li>Preparare 0,75 mL di soluzione di patch contenente un fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594) e un indicatore verde sintetico calcio (ad es., Oregon Green BAPTA-1; si veda tabella 1). Includono biocitina (Vedi tabella 1) nella soluzione di patch se post hoc, identificazione morfologica delle cellule registrate è necessario.</li>
	<li>Regolare l'osmolarità della soluzione a 280 ± 5 mOsm e pH a 7,35 ± 0,5. Conservare la soluzione in frigorifero o su ghiaccio in ogni momento. Nota: Scelta dell'indicatore del calcio dovrebbe essere basata sulla sua gamma dinamica e la natura degli esaminatori Ca2 + eventi.</li>
	<li>Utilizzando un estrattore micropipetta, preparare pipette patch dai vasi capillari di vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali) con una punta di 2 µm ≈ (pipetta resistenza di 3-5 MΩ) e stimolazione pipette da capillari di teta-vetro borosilicato (Vedi tabella di Materiali) con una punta di 2-5 µm. Nota: Le impostazioni di estrattore per rendere pipette di un determinato diametro e la forma saranno determinate dal tipo di filamento di estrattore e i risultati del test di rampa per un determinato tipo di vetro.</li>
</ol>2. hippocampal fetta preparazione
<ol><li>Anestetizzare il mouse (P13-20; il ceppo e sesso del mouse è determinata dalla questione sperimentale affrontata) con 1 mL di isoflurane collocata su un tovagliolo di carta all'interno di una camera di narcosi per inalazione. Quando l'animale è anestetizzato, come evidenziato da una mancanza di movimento e respirazione lenta, rimuoverlo dalla camera di narcosi e decapitare utilizzando una ghigliottina.</li>
	<li>Esporre il cranio tagliando la pelle con un piccolo paio di forbici dalla parte posteriore del cranio al naso. Utilizzare un piccolo paio di Pinze ossivore mini osso per fare un buco a livello di bregma. Quindi utilizzare le forbici per fare un taglio caudale--rostrale lungo la sutura sagittale. Con le Pinze ossivore afferrare sul retro di ogni lembo di cranio e ascensore verso l'alto e verso l'esterno per rimuovere il teschio che coprono ogni emisfero.</li>
	<li>Dopo che il cervello è completamente esposto, inferiori a quelli dei nervi ottici con una spatolina. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente continuamente ossigenato, freddo ACSF-saccarosio (Vedi tabella 1 per la concentrazione di saccarosio).<ol>
<li>Se il tessuto da più vecchi topi è richiesto, eseguire una perfusione intracardiaca usando una siringa (25G) riempita con 20 mL di gelida ACSF-saccarosio prima dell'estrazione del cervello per ottenere fette di buona qualità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare fette hippocampal del cervello animale estratti.<ol>
<li>Posizionare un pezzo di carta da filtro su una piastra di Petri ricco di ghiaccio, trasferire il cervello sulla carta da filtro, lasciare che il freddo di cervello per circa 2 min. Sezionare i due emisferi.</li>
		<li>Incollare gli emisferi dissecati (l'orientamento è determinato dallo scopo sperimentale per ottenere fette di coronale, trasversale o orizzontale) su una tabella del vibratome e immergetelo nel vassoio vibratome riempito con gelida ossigenato ACSF-saccarosio. Fare 300 µm fette spesse ad una temperatura di circa 1 ° C utilizzando un dispositivo di raffreddamento del vibratome o mettendo il ghiaccio intorno il vassoio del vibratome.</li>
		<li>Utilizzando un pennello piatto, si accumulano le fette contenente l'ippocampo (fino a 6 fette per emisfero) in un bagno contenente ossigenato ACSF-recupero riscaldato a 37 ° C.</li>
		<li>Lasciare le fette nel bagno ACSF-recupero per almeno 45 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cellule intere Patch-clamp registrazioni
<ol><li>Impostare una fetta hippocampal in posto in un bagno posizionato sotto l'obiettivo (ingrandimento: 40x, apertura numerica: 0.8) di un microscopio a due fotoni scansione laser. Irrorare continuamente il bagno con ossigenato ACSF-normale riscaldata a 30-32 ° C a una velocità di 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Utilizzare contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC) o microscopia Dodt-SGC per individuare una cella di interesse utilizzando la dimensione, la forma e la posizione. Nota: A seconda della popolazione mirata del neurone, un modello di topo transgenico può essere utilizzato per individuare facilmente le celle di interesse. In questo caso, questo passaggio può essere sostituito con l'uso di una fonte di luce fluorescente.</li>
	<li>Riempire una pipetta di stimolazione con una soluzione di ACSF-normale che contiene il fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594).</li>
	<li>Impostare la pipetta di stimolazione (collegata a un'unità di stimolazione elettrica) sopra la fetta in modo che la punta è nella stessa regione come la cellula di interesse.</li>
	<li>Dopo aver compilato la pipetta patch con soluzione di patch e allegarlo ad una fase di testa, impostarlo sulla fetta in modo che la sua punta è direttamente sopra la cella di interesse.</li>
	<li>Inserire una siringa un rubinetto a tre vie e collegarlo al patch-pipetta attraverso il tubo di plastica. Iniettare una pressione positiva costante nella pipetta patch (≈ 0,1 mL) usando la siringa. Tenere il rubinetto in posizione "close".</li>
	<li>Attivare il modulo di software di controllo amplificatore e passare alla modalità tensione-morsetto cliccando sul pulsante "VC". Aprire il software di acquisizione dati di elettrofisiologia (ad esempio, clampex) per l'acquisizione di segnali elettrofisiologici e cliccare sull'icona "Membrana Test" di averlo continuamente invia un impulso di tensione quadrati (5 mV, 10 ms), che è necessario monitorare cambiamenti nella resistenza pipetta.</li>
	<li>Abbassare la pipetta patch fino a quando non è proprio sulla cima della cella mirata. Al momento di fare contatto con la membrana cellulare, rimuovere la pressione ruotando il rubinetto nella posizione "aperta". Nota: Il contatto con la membrana cellulare viene rilevato quando un piccolo aumento nella resistenza pipetta (≈ 0.2 MΩ) è visto e una piccola rientranza sulla cella è causata da pressione positiva.</li>
	<li>Esercitare una leggera pressione negativa per la pipetta patch usando una siringa vuota nel rubinetto fino a quando la resistenza di pipetta fornita dal software raggiunge 1 GΩ. Nella finestra 'Membrana Test' dei software di acquisizione dati, fissare la cella a -60 mV.</li>
	<li>Continuare ad applicare pressione negativa fino a quando la cella viene aperta e la configurazione di cellule intere è raggiunto. Rilevamento di questo stato della cellula si basa sull'improvviso cambiamento nella resistenza pipetta (da 1 GΩ a MΩ 70-500 a seconda del tipo di Interneurone) e la comparsa di grandi capacitivi transitori nella finestra 'Membrana Test'.</li>
</ol>4. due-fotone Ca2 + Imaging
<ol><li>Se ti interessa le risposte postsinaptiche eccitatori, aggiungere il gabazine di blocco del recettore GABAA (10 µM) e il blocco del recettore GABAB CGP55845 (2 µM) nel bagno ACSF.</li>
	<li>Nel modulo amplificatore software di controllo, impostare la configurazione di patch al corrente-morsetto cliccando sul pulsante "CC" e registrare schema di attivazione della cellula in risposta alle iniezioni somatiche di depolarizzanti corrente (0.8-1.0 nA, 1 s). Aspettare almeno 30 minuti per la cella per essere riempito con gli indicatori presenti nella soluzione patch. Nota: Schema di attivazione della cellula e la proprietà attive possono essere utilizzate per identificare il sottotipo della cella; per esempio, cellule fast-chiodare. È importante per la concentrazione di indicatore stabilizzare attraverso diffusione prima di avviare la registrazione gatti (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
	<li>AP-evocato gatti<ol>
<li>Utilizzando il software di acquisizione immagini, avviare l'acquisizione delle immagini. Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa. Per garantire una risposta visibile, in primo luogo, scegliere un dendrite prossimale (≤ 50 µm) come l'efficienza di AP backpropagation può diminuire in modo significativo con distanza di interneuroni GABAergici22.</li>
		<li>Utilizzando lo strumento rettangolare nel software di acquisizione immagini, ingrandire la regione di destinazione e passare per il "xt" (linescan) modalità. Posizionare la scansione attraverso il ramo dendritico di interesse. Con i controllori di intensità laser del software di acquisizione, è necessario impostare il laser del due-fotone ad un livello di potenza minimo cui fluorescenza verde della linea di base è solo leggermente visibile, per evitare di fototossicità.</li>
		<li>Nel software di elettrofisiologia per la acquisizione di dati software di acquisizione di finestra e l'immagine di «Protocollo», creare una registrazione di prova della durata desiderata contenente un'iniezione di corrente somatica dell'ampiezza desiderata.<ol>
<li>Utilizzando il software di acquisizione immagini, fare clic sul pulsante "Start record" e acquisire la fluorescenza continuamente per 1-2 s. Ripetere l'acquisizione dell'immagine 3 - 10 volte. Attendere almeno 30 s tra singole scansioni per evitare photodamage. Se l'acquisizione di scansioni in più punti lungo un dendrite, portarli in ordine casuale per evitare effetti di ordine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sinapticamente-evocato gatti<ol>
<li>Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa.</li>
		<li>Impostare la pipetta di stimolazione sulla superficie della fetta sopra il dendrite di interesse. Abbassare lentamente la pipetta di stimolazione in posizione, riducendo al minimo movimento per evitare di disturbare la configurazione di cellule intere. Posizione la pipetta a 10-15 µm dal dendrite.</li>
		<li>Per visualizzare la posizione di microdomini sinaptici nei dendriti di Soma, il software di acquisizione immagine passare ai 'xt' (linescan) modalità e posizionare la linea lungo il ramo dendritico di interesse.</li>
		<li>Nella finestra 'Protocollo' (di software di acquisizione dati di elettrofisiologia) e software di acquisizione immagini, creare un processo di registrazione che attiva l'unità di stimolazione dopo l'inizio della prova.</li>
		<li>Utilizzando il software di acquisizione, fare clic sul pulsante "Start record" per eseguire la scansione lungo dendrite continuamente per 1-2 s. Repeat acquisizione 3 - 5 volte, in attesa di 30 s tra le scansioni per impedire il photodamage. Nota: La lunghezza di scansione può essere regolata a seconda della cinetica dell'evento evocati, ma deve essere ridotto al minimo per impedire il photodamage (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.5.5 in condizioni diverse (ad esempio, diversa intensità/durata della stimolazione, l'introduzione di un blocco farmacologico, ecc.) a seconda della specifica domanda affrontata.</li>
		<li>Interrompere l'acquisizione quando la cella Mostra segni di deterioramento della salute: depolarizzazione sotto -45 mV, aumento della linea di base livello di Ca2 + , deterioramento morfologico dei dendriti (ad es., blebbing, frammentazione; Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
		<li>Per ottenere informazioni preliminari sulla morfologia della cella e tenere traccia della posizione della pipetta stimolazione, acquisire uno Z -stack della cella nel canale del rosso. Utilizzando il software di acquisizione in 'xyz' modalità, impostare i limiti superiore e inferiore dello stack per l'intera cella di immagine con tutti i processi inclusi. Dimensionare la ' passo ' a 1 µm e avvia l'acquisizione dello stack utilizzando il pulsante "Start record".</li>
		<li>Quando la Z-stack acquisizione è completo, utilizzare l'opzione di "Proiezione massima" nel software per sovrapporre tutti i piani focali dello stack e verificare la qualità di acquisizione. Quindi, ritirare lentamente la pipetta patch fuori la fetta.</li>
		<li>Per correggere la fetta per post hoc, identificazione morfologica, rapidamente rimuovere la fetta dal bagno utilizzando un pennello piatto e posizionarlo tra due fogli di carta filtro, in una capsula di Petri ACSF-riempito. Sostituire il ACSF con una soluzione di paraformaldeide (PFA) di 4% e lasciare il piatto in una camera di 4 ° C o in frigorifero durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. esame immuno-istochimico per Post Hoc identificazione morfologica delle cellule registrate
Nota: Dopo 1 notte della fissazione in PFA, la fetta può essere conservata in tampone fosfato (PB) con sodio azide (0,5%) per fino a 1 mese.
<ol><li>Mettere la fetta in soluzione salina tamponata (TBS) con Triton X-100 (0,3%) ed effettuare 4 lavaggi (5-10 min).</li>
	<li>Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 10% siero di capra normale (NGS) per 1 h.</li>
	<li>Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 1% NGS ed un fluoroforo streptavidina coniugata (ad es., Alexa Fluor 546-coniugato streptavidina, 1: 200) per incubazione di notte.</li>
	<li>Lavare 4 volte (5-10 min) in TBS.</li>
	<li>Montare fette su vetrini da microscopio e immagine utilizzando un microscopio confocale. Per una ricostruzione completa delle cellule, acquisire un Z-stack (passo dimensioni: 1 µm) utilizzando un obiettivo 20x. Per l'imaging di un'etichetta di Alexa-546-coniugato, utilizzare che un laser a 543 nm e una rilevazione di 515-560 nm filtro impostato.</li>
</ol>6. analisi dei gatti
<ol><li>Estrarre i valori di fluorescenza da regioni di interesse (ROI) nelle immagini linescan dai canali rossi e verde e media dei valori delle ripetizioni multiple per ogni condizione per ridurre il rumore. Nota: Quando acquisizione linescan viene eseguito lungo dendrite, è possibile estrarre dati da ROIs multipli, che possono corrispondere a dendritiche microdomini (2-5 µm), e consentendo così lo studio della compartimentazione di segnale Ca2 + .</li>
	<li>Per ogni ROI, esprimere le variazioni di Ca2 + ampiezza come: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Nota: Qui G è il valore di fluorescenza dal canale verde; G0 è il valore di fluorescenza di base dal canale verde durante il periodo di pre-stimolazione; R è il valore di fluorescenza dal canale rosso18. Come eccitazione del due-fotone è altamente localizzato e non genera un significativo background, sottrazione di fluorescenza di fondo non è necessario.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. 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C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Il metodo illustrato di seguito viene illustrato l'utilizzo della combinazione del due-fotone Ca2 + imaging ed elettrofisiologia di patch-clamp per lo studio dendritiche Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto. Questo metodo consente per il monitoraggio di entrambi i locali Ca2 + prospetti evocati da AP elettrici di stimolazione o backpropagating in segmenti dendritiche e risposta somatica della cella. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare come ...

Il contributo di un neurone per attività di rete è in gran parte determinato dalla natura dinamica degli ingressi sinaptici che riceve. Tradizionalmente, il metodo predominante di caratterizzare l'attività sinaptica nei neuroni è invocata da registrazioni di intero-cellula somatica patch clamp di correnti postsinaptiche evocate da stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. Tuttavia, unica attività delle sinapsi prossimalmente trova veritiero è segnalato in questo caso1. Inoltre, per valutare i meccanismi specifici di sinapsi, registrazioni da coppie di neuroni e da dendriti in una posizione specifica sono state utilizzate per indirizzare le sinapsi di interesse e i meccanismi di integrazione dendritiche, rispettivamente. Un importante passo avanti nel campo della fisiologia sinaptica è stato realizzato attraverso un connubio di tecniche ottiche ed elettrofisiologiche. Microscopia (2PLSM) in combinazione con Ca2 + imaging e optogenetica strumenti a scansione laser di eccitazione del due-fotone può rivelare dettagli tremende dell'organizzazione dinamica dell'attività sinaptica alle connessioni neuronali specifiche nelle fette del cervello in vitro ed in vivo.
Parecchi vantaggi chiave ha reso 2PLSM risaltare dalla microscopia convenzionale, uno-fotone eccitazione2: (1) a causa di una natura non lineare del due-fotone eccitazione, la fluorescenza viene generata solo nel volume focale, e rappresentano tutti i fotoni emessi segnali utili (senza bisogno di foro di spillo); (2) lunghezze d'onda, utilizzato in 2PLSM, penetra il tessuto di dispersione in modo più efficiente; Inoltre, sparsi i fotoni sono troppo diluiti per produrre eccitazione del due-fotone e fluorescenza di fondo; (3) photodamage e fototossicità sono limitate al piano focale. Di conseguenza, nonostante l'alto costo dei sistemi di 2 fotoni rispetto ai convenzionali microscopi confocali, il 2PLSM rimane un metodo di scelta per le indagini ad alta risoluzione della struttura neuronale e funzione nel tessuto vivente spessa.
La prima applicazione del 2PLSM nel tessuto di scattering è stato all'immagine della struttura e la funzione delle spine dendritiche3. 2PLSM in combinazione con Ca2 + formazione immagine ha rivelato tale funzione di spine come compartimenti biochimici isolati. Poiché in molti tipi di un neurone c'è una corrispondenza univoca tra spine e singole sinapsi4, due-fotone Ca2 + imaging presto divenne un utile strumento di reporting dell'attività delle singole sinapsi in tessuto intatto5, 6,7,8. Inoltre, 2PLSM-Ca2 + l'imaging basato su è stato usato con successo per monitorare l'attività dei canali del calcio singolo e le interazioni non lineari tra le conduttanze intrinseche e sinaptiche, nonché di valutare lo stato - e attività-dipendente regolamento del Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali5,6,7,8,9,10,11.
Il calcio è un secondo messaggero intracellulare onnipresente, e relativa organizzazione subcellulare spatiotemporal determina la direzione di reazioni fisiologiche, da cambiamenti nella forza sinaptica del regolamento dello ione di canali, crescita dendrite e della colonna vertebrale, come così come la morte delle cellule e la sopravvivenza. Dendritiche Ca2 + quote altimetriche si verificano attraverso l'attivazione di vie multiple. Potenziali di azione (APs), backpropagating per i dendrites, aperto tensione-gated del calcio canali12 e produrre relativamente global Ca2 + transitori (gatti) in dendriti e spine13. Trasmissione sinaptica è associata con l'attivazione di postsinaptica Ca2 +-permeabili recettori (NMDA, Ca2 +-permeabile AMPA e kainato), attivazione sinaptica gatti6,14,15. Infine, gli eventi possono Ca2 + possono essere generati nei dendriti sotto determinate circostanze11,12,13,16.
Si avvale di due fotoni Ca2 + imaging in combinazione con le registrazioni elettrofisiologiche patch clamp sintetico Ca2 +-sensibili indicatori fluorescenti, che in genere sono trasportati attraverso l'elettrodo di patch durante le registrazioni della intero-cellula . Un metodo standard per la quantificazione delle dinamiche2 + Ca è basato sul doppio indicatore metodo17,18. Utilizza due fluorofori con spettri di emissione ben separati (ad esempio, una combinazione di un rosso Ca2 +-insensibile tintura verde Ca2 + indicatori, quali Oregon Green BAPTA-1 o Fluo-4) e ha diversi vantaggi rispetto alla Metodo unico indicatore. Prima di tutto, a Ca2 +-insensibile colorante viene utilizzato per individuare piccole strutture di interesse (rami dentritici e spine) dove verrà eseguita Ca2 + formazione immagine. In secondo luogo, il rapporto tra la variazione di fluorescenza verde e rosso (ΔG/R) viene calcolato come una misura di [Ca2 +], che è in gran parte insensibile ai cambiamenti di fluorescenza della linea di base a causa di fluttuazioni [Ca2 +]017 , 18. Inoltre, i cambiamenti di fluorescenza possono essere calibrati in termini assoluti Ca2 + concentrazioni19.
Una preoccupazione generale durante l'esecuzione di due fotoni Ca2 + imaging esperimenti in fettine acute è la salute delle cellule e la stabilità dell'acquisizione immagine a causa della laser ad alta potenza in genere utilizzata. Inoltre, in esperimenti di Ca2 + imaging, c'è preoccupazione per la perturbazione e sostanza sovrastima del servizio subcellulare2 + dinamiche per Ca dovuta al fatto che fungono da indicatori di Ca2 + altamente mobile esogeno Ca2 + buffer. Così, la scelta dell'indicatore di Ca2 + e la sua concentrazione dipende il tipo di un neurone, l'ampiezza prevista dei gatti e la questione sperimentale.
Abbiamo adattato il metodo di due fotoni Ca2 + imaging per indagine di Ca2 + fluttuazioni nei dendriti dei neuroni GABAergici interneuroni9,10,11,20,21 , 22. mentre la maggior parte del Ca2 + imaging gli studi iniziali sono stati fatti nei neuroni principali, interneuroni inibitori mostrare una varietà grande di Ca2 + meccanismi funzionali che sono distinti da quelli a cellule piramidali20 , 23 , 24. questi meccanismi di Interneurone specifici (ad es., Ca2 + permeabili i recettori AMPA) possono svolgere ruoli specifici nel regolare l'attività delle cellule. Mentre dendritiche Ca2 + segnalazione in interneuroni è un obiettivo allettante per ulteriori indagini, due-fotone Ca2 + imaging nei dendriti di queste cellule presenta sfide aggiuntive, da un diametro più sottile dei dendriti e la mancanza di spine per una particolarmente elevato Ca2 + associazione capacità endogena. Come la nostra ricerca interessi riguardano lo studio di interneuroni hippocampal, il seguente protocollo, mentre applicabili a differenti popolazioni neuronali, è stato adattato per affrontare queste sfide.
Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio a due fotoni confocale commerciale, che era dotato di due rivelatori esterni, non descanned (NDDs), modulatore elettro-ottico (EOM) e un Dodt scansione contrasto sfumatura (SGC) e installato su un tavolo ottico. Il microscopio è stato accoppiato con un laser di multiphoton costituita mode-locking a 800 nm (> 3 W, 140 fs legumi, tasso di ripetizione di 80 Hz). Il sistema di imaging è stato dotato di un impianto di perforazione di elettrofisiologia standard, tra cui una camera di aspersione con controllo della temperatura, una piattaforma di traduzione con due micromanipolatori, un amplificatore microelettrodo computerizzato, un digitalizzatore, una stimolazione unità e software di acquisizione dati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

La formazione immagine del calcio (Ca2 +) è un potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di Ca2 + segnali intracellulari nei dendriti neuronali. CA2 + fluttuazioni possono verificarsi attraverso una varietà di meccanismi intracellulari e di membrana e svolgono un ruolo cruciale nell'induzione di plasticità sinaptica e nella regolazione dell'eccitabilità dendritiche. Quindi, la possibilità di registrare diversi tipi di Ca2 + segnali in rami dentritici è preziosa per gruppi studiano come dendriti integrano informazioni. L'avvento della microscopia del due-fotone ha reso tali studi significativamente più facile risolvendo i problemi inerenti all'imaging in tessuto vivo, come ad esempio la dispersione della luce e photodamage. Inoltre, attraverso la combinazione di tecniche elettrofisiologiche convenzionale con due fotoni Ca2 + imaging, è possibile indagare locale Ca2 + le fluttuazioni nei dendriti neuronali in parallelo con le registrazioni di attività sinaptica Soma. Qui, descriviamo come utilizzare questo metodo per studiare la dinamica locale Ca2 + transitori (gatti) nei dendriti di interneuroni inibitori GABAergici. Il metodo può essere applicato anche allo studio dendritiche Ca2 + segnalazione in diversi tipi di un neurone in fettine di cervello acuto.

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo ottenuto gatti evocati mediante iniezione di corrente somatica e da stimolazione elettrica nei dendriti di oriens/alveus interneuroni nella zona CA1 dell'ippocampo. Dopo la patch di un neurone, identificato basata sulla sua forma e la posizione, abbiamo acquisito scansioni attraverso un dendrite prossimale in più punti al dato Distanze dal soma (Figura 1A). Abbiamo osservato una diminuzione dell'ampiezza dei ...

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Views.  Université Laval. Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Video: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ricerca

Neuroscienze

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...