The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

Questi protocolli sono stati approvati dalla Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Protocollo n. 139). 1. Preparazione degli animali <ol><li> Mantenere gli adulti e le larve a 28 ° C su un 14 hr: luce 10 ore: ciclo scuro. Nutrire gli adulti due volte al giorno con Artemia guscio prive (decapsulated, non tratteggio, a partire da 14 DPF) e micropellet commerciali. </li><li> Questi protocolli sono ottimizzati per l&#39;uso di 6-7 dpf larve raccolte dalla riproduzione naturale dello sfondo AB. I protocolli possono essere modificati per le larve di altre età e provenienza. Non fornire cibo esogeno prima del 6 dpf. </li><li> Anestetizzare larve con Tricaine in mezzi dell&#39;embrione (EM) (4,2 ml di 4 mg / ml Tricaine per 100 ml EM) a temperatura ambiente (RT). </li></ol> 2. Preparazione di ricchi di lipidi tuorlo d&#39;uovo feed <ol><li> Preparare e memorizzare i tuorli d&#39;uovo di pollo. Separare il tuorlo e bianco di 12 uova di gallina. Pool i tuorli, aliquota 1 ml in 1,5tubi ml e conservare a -80 ° C fino a 1 anno (12 tuorli faranno ~ 80 aliquote). PISCINA La bianchi, negozio, e usare come, mangimi ricchi di proteine ​​lipidi-poveri. </li><li> Preparare analogico lipide fluorescente (s) da aggiungere al feed tuorlo se desiderato. <ol><li> Sospendere l&#39;acquistato, in polvere analogico lipidi fluorescente in 100% di etanolo o il 100% cloroformio a 0,1 mg / mL (vedi nota seguente discutere solventi), aliquota in tubi di vetro opaco, sigillare con parafilm e conservare il prodotto secondo le istruzioni del produttore. A causa della rapida evaporazione dei solventi organici non utilizzare volumi di aliquote inferiori a ~ 400 microlitri per l&#39;archiviazione a lungo termine. Nota: Se l&#39;analogo lipidico viene sospeso in etanolo, grandi volumi di analogico lipidi saranno utilizzati perché si asciuga velocemente sotto N 2 di cloroformio. Se l&#39;analogo lipidico viene sospeso in etanolo non deve essere essiccato e risospeso prima di aggiungerlo al feed liposomi nel passaggio 2.2.4, ma la concentrazione totale di etanolo non deve superare 0.1% nel feed liposomi per evitare effetti fisiologici potenzialmente confondenti di etanolo. </li><li> Per analoghi di acidi grassi fluorescenti: Preparare un volume totale di 20 ml 5% emulsione di tuorlo d&#39;uovo in EM. Da quel preparare 5 ml aliquote con una concentrazione finale di 6,4 mM 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY C 16) per saggi di imaging confocale vivo e assunzione di cibo o 1 mg / ml BODIPY C 12 per l&#39;imaging stereomicroscopio. Trasferire la quantità desiderata di analogico lipide fluorescente in un tubo di plastica da 1,5 ml. Essiccare il lipide in corrente di N 2, avendo cura di non soffiare il lipide dal tubo. </li><li> Immediatamente, risospendere in 5 ml di etanolo al 100% pipettando un torrente lungo i lati del tubo, aggiungere 95 ml di EM, e mescolare bene. Nota: La miscela deve apparire omogeneo; se lipidi colorato rimane sui lati del tubo o il liquido non appare clumpy, il lipide non ha pienamente solubilizzazione e richiede più etanolo. Proteggere il tubo di from luce e conservare su ghiaccio. </li><li> Per fluorescente analogico colesterolo: preparare una concentrazione finale di colesterolo 2,4 mg / ml in 5 ml 0,5-5% di tuorlo d&#39;uovo emulsione per studi di imaging dal vivo. Trasferire la quantità desiderata del colesterolo in un tubo di plastica da 1,5 ml. Essiccare il lipide in corrente di N 2, avendo cura di non soffiare il lipide dal tubo. </li><li> Immediatamente, risospendere in 15 ml di RT 100% di etanolo pipettando un torrente lungo i lati del tubo e mescolare con 85 ml di RT 1% grassi BSA privi di acido in H 2 O. purificato Proteggere il tubo dalla luce e memorizzare sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare tuorlo d&#39;uovo liposomi Feed. <ol><li> Aggiungere un&#39;aliquota scongelato di tuorlo d&#39;uovo EM in una provetta conica da 50 ml. Agitare la miscela di tuorlo diluito per 1-2 minuti; la miscela deve apparire come una emulsione omogenea. </li><li> Versare il composto attraverso un colino a maglia fine per rimuovere conglomerati proteici e raccogliere in un nuovo, da 50 ml tubo conico fresco. </li><li> Sonica PulseTE il composto di uova con un microtip rastremata un quarto di pollice (5 volte (5 x 1 sec su, 1 sec spento), fermandosi 5-10 secondi tra ogni serie; intensità di uscita: 6 W) a temperatura ambiente per creare liposomi. impostazioni di alimentazione sonicator sono strumento dipendente e richiedono pertanto l&#39;ottimizzazione per ogni strumento e microtip. Nota: continuamente il rock miscela liposomi a temperatura ambiente per mantenere l&#39;omogeneità fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere l&#39;analogo lipide fluorescente per i liposomi tuorlo d&#39;uovo, se desiderato. Subito dopo sonicazione, pipettare i lipidi preparati nella miscela liposomi e vortex ad alta velocità per 30 secondi per incorporare nei liposomi. Proteggere la miscela dalla luce avvolgendo il tubo in carta stagnola e continuare a dondolo a temperatura ambiente. </li></ol> 3. alimentazione Paradigma <ol><li> Preparare le larve per l&#39;alimentazione. <ol><li> Prima di iniziare il feed, larve schermo per difetti morfologici evidenti che possono ostacolare l&#39;alimentazione. Trasferimento larve di 60 mm x 15 mm piastre Petri o 6 o 12 ben plates, ridurre EM al minimo, e sostituirlo con 5 ml della soluzione di liposomi preparata. </li><li> Se necessario, trasferire digiuni larve di controllo al 5 ml EM e / o 5 ml 5% albume in EM e trattare in parallelo. </li></ol></li><li> Agitare delicatamente le larve in una sedia a dondolo in incubazione (29-31 ° C a 30 giri al minuto) negli alimenti per favorire l&#39;assunzione di cibo, pur continuando a proteggere dalla luce se analoghi lipidici fluorescenti sono presenti. Se necessario le larve di essere esposti alla luce, ridurre al minimo l&#39;esposizione con una copertura in vetro colorato incubatore. </li><li> Alla fine del periodo di alimentazione, risciacquare le larve nuotano liberamente in EM 3 volte. Nota: Le larve può iniziare consumando liposomi in qualsiasi momento durante l&#39;avanzamento. Se è fondamentale che le larve iniziare alimentando contemporaneamente, protezione per l&#39;assunzione di cibo (vedi 3.4) dopo 1 ora di avanzamento e di ritorno solo larve che hanno iniziato alimentando all&#39;emulsione tuorlo d&#39;uovo per completare l&#39;alimentazione. </li><li> Schermo le larve a questo punto per l&#39;assunzione di cibo come un piccolo numero non può EAt (generalmente ~ 0-5%). Esaminate l&#39;intestino delle larve che sono stati anestetizzati o leggermente raffreddati su un blocco di metallo su ghiaccio per determinare se sono alimentati: larve che hanno consumato liposomi avrà un intestino oscurata (Figura 1). </li><li> Immagine o un processo larve per l&#39;assunzione di cibo immediatamente. In alternativa, posto larve in acqua dolce EM e incubare a 28 ° C per permettere l&#39;elaborazione metabolico a verificarsi. </li></ol> 4. Montaggio Le larve per Live Imaging <ol><li> Preparare il supporto di montaggio. <ol><li> Per 3% metilcellulosa: aggiungere 0,75 g metilcellulosa a 25 ml di ebollizione vicino EM, vortice, roccia a temperatura ambiente 2-3 giorni fino a completa dissoluzione, e conservare a 4 ° C per anni a -20 ° C. ripetuti cicli di congelamento e scongelamento a 4 ° C rimuoveranno le bolle d&#39;aria. Conservare 3% metilcellulosa sul ghiaccio durante il montaggio larve. </li><li> Per 1,2% a basso monte agarosio: aggiungere 0,3 g di bassa fondere agarosio a 25 mL EM e sciogliere portando ad ebollizione, un&#39;aliquota in 2 ml tUBE, e mantenere a 26-28 ° C su un blocco di calore. aliquote non utilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente oa -20 ° C e bollito di nuovo al momento dell&#39;uso. Assicurarsi che agarosio è abbastanza fresco da gestire prima di esporlo a larve o possono essere riscaldato eccessivamente. </li></ol></li><li> Per basso ingrandimento, medio-throughput imaging dal vivo, inserire un vetrino su un tessuto su un blocco di metallo su ghiaccio e attendere la diapositiva raffreddare. Applicare una generosa quantità del 3% metil cellulosa (che è stata mantenuta a 4 ° C in ghiaccio) sul vetrino, trasferire una larva sul metilcellulosa 3%, utilizzando un poker lenza (lenza diametro 0,41 millimetri incollato al all&#39;estremità di un tubo capillare di vetro) creare un troth per drenare l&#39;eccesso EM (in modo che metilcellulosa non diluito) e posizionare le larve come desiderato. </li><li> Per breve termine (&lt;20 min), ad alto ingrandimento di immagini dal vivo con un obiettivo in posizione verticale di emersione olio, montare le larve con il vetrino tettoia metodo. <ol><li> Utilizzare colla a base di cianoacrilato (supercolla) percollegare aa 22 mm x 30 millimetri coprioggetto ad una estremità di un vetrino. Utilizzare un poker per mettere una sottile linea di 3% metilcellulosa sulla diapositiva adiacente al vetrino e trasferire le larve alla slitta con un ampio foro Pasteur pipetta. Rimuovere l&#39;eccesso EM in modo da non diluire la metilcellulosa. </li><li> Utilizzando una mazza, posizionare delicatamente larve in metilcellulosa sui loro lati (lato sinistro fino a un&#39;immagine più del fegato, destra rivolto verso l&#39;alto per l&#39;immagine della cistifellea) con la testa accanto al coprioggetto. </li><li> Spot superglue negli angoli di un secondo vetrino e delicatamente posto un bordo del vetrino sul vetrino montato e l&#39;altra sul vetrino, colmando le larve. Fare attenzione a non applicare una pressione eccessiva durante questo passaggio o con l&#39;obiettivo, mentre per immagini in modo che le larve rimanere illeso. </li></ol></li><li> Per lungo termine, immagini ad alto ingrandimento con un obiettivo ad immersione in posizione verticale, montare le larve in agarosio. Aggiungere una larva di una piccola aliquota di 1,2% bassa temperatura di fusione agarosio quindi trasferire illarva in un piccolo volume di agarosio ad una piastra di Petri. <ol><li> posizionare rapidamente le larve con un poker prima i solidifica agarosio. Lasciare che il agarosio asciugare per 2-3 minuti e coprire l&#39;agarosio pienamente fresca EM per evitare che si secchi. </li></ol></li><li> Per lungo termine, immagini ad alto ingrandimento con un obiettivo invertito, montare larve su un piatto di vetro-bottom in agarosio. <ol><li> Raffreddare un blocco metallico su ghiaccio. Porre la capsula sul blocco metallico separati da un tessuto per impedire il raffreddamento eccessivo e larvale congelamento. Trasferire una larva al piatto e rimuovere la EM wicking con un tessuto. </li><li> Mettere una goccia di 28 ° C bassofondente agarosio (1,2%) al di sopra della larva e subito posizionare con una mazza (lato sinistro verso il basso per migliore immagine fegato, lato destro verso il basso per l&#39;immagine della cistifellea). Rimuovere piatto dal blocco freddo, lasciare asciugare per 2-3 minuti, e aggiungere un volume sufficiente di EM fresco per coprire l&#39;agarosio (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> Intake 5. Il cibosaggio <ol><li> Al termine di un feed liposomi tuorlo contenente 6,4 mM BODIPY C 16, in comune un minimo di 10 larve lavato in un tubo di plastica da 1,5 o 2 ml, togliere EM, e scattare congelamento. I campioni possono essere conservati a -80 ° C al riparo dalla luce per diversi mesi. Nota: Se possibile, raccogliere più replicati. È importante raccogliere larve unfed in questa fase per normalizzare per sfondo lipidi fluorescenza (idealmente larve della frizione stessa vengono utilizzati). </li><li> Eseguire una versione modificata Bligh-Dyer estrazione del grasso 3,21. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri tampone di omogeneizzazione (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) per il campione sul ghiaccio (H 2 O in alternativa purificata può essere utilizzato). Omogeneizzare su ghiaccio con un sonicatore microtip (5 sec totale: 1 sec su 1 sec spento). Verificare che le larve sono completamente omogeneizzato; in caso contrario ripetere. Trasferire in una provetta di vetro cultura usa e getta ml 13 (altri tubi di vetro possono essere utilizzate). Nota: Il cloroformio è pericoloso; eseguire tutte le successive ex lipidifasi di trazione a temperatura ambiente in una cappa chimica. </li><li> Per ogni 100 ml di tampone di omogeneizzazione utilizzati, aggiungere 375 ml di 1: 2 (cloroformio: metanolo). Vortex 30-60 sec, incubare 10 minuti, aggiungere 125 ml di cloroformio per 100 buffer di omogeneizzazione microlitri usato, e vortex 30 sec. </li><li> Aggiungere 125 ml di 200 mM Tris pH 7.5 a 100 buffer di omogeneizzazione microlitri utilizzato, vortice 30 sec, e centrifugare (2.000 x g, 5 min, RT, protetto dalla luce). Rimuovere con attenzione i campioni dalla centrifuga. Verranno separati in due fasi: una fase acquosa superiore è, un&#39;interfaccia di detriti larvale, e una fase organica inferiore (contiene lipidi). </li><li> Con una pipetta di vetro pulita raccogliere fondo, fase organica e trasferirlo in una provetta pulita di vetro 13 ml. Nota: Fare attenzione ad evitare la fase acquosa e detriti larvale a livello di interfaccia; in caso di contaminazione, ripetere il passaggio centrifugazione e Rammentare. Eliminare la fase superiore, acquosa; può essere utile per rimuovere ed eliminare questofase prima di raccogliere la fase organica. Il campione può essere conservato a -80 ° C per un massimo di 1 mese. </li><li> Essiccare la fase organica sotto vuoto (0,12 atm) mentre protegge dalla luce. Non continuare ad asciugare i campioni dopo che il liquido è evaporato quanto ridurrà liposolubilità. Risospendere i lipidi in 2: 1 (cloroformio: metanolo) e memorizzare sul ghiaccio. Il volume ottimale del cloroformio: metanolo soluzione dipende dal metodo di rilevamento utilizzato; iniziare a bassa e continuare a diluire in base alle esigenze. Una linea guida generale è di usare 10 ml per 10 larve in pool. </li></ol></li><li> Trova le interi volumi di esempio in intervalli regolari su un piatto TLC incanalata e la scansione del piatto con uno scanner laser solitamente usata per l&#39;imaging biomolecolare (ad esempio, un lettore di piastre a fluorescenza). Per gli analoghi lipidici fluorescenti inclusi nella lista dei materiali che hanno un massimi di eccitazione 500-650 nm ed emissione massimi 510-665 nm, utilizzare un laser 488 nm e con la raccolta di emissione a 520 nm. <ol><li> Quantificare la fluorescenza totale di ogni spot con software di imaging. Nota: corretto per naturale sfondo lipidi fluorescenza sottraendo la fluorescenza di appaiati, campioni larvali digiuni. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carten, J. D., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+system+swims+into+focus:+using+the+zebrafish+to+visualize+intestinal+metabolism+in+vivo.">A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo.</a> Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).</li><li>Babin, P. J., Vernier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+lipoproteins+in+fish.">Plasma lipoproteins in fish.</a> J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).</li><li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish.">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).</li><li>Marza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+and+nutritional+regulation+of+a+zebrafish+gene+homologous+to+mammalian+microsomal+triglyceride+transfer+protein+large+subunit.">Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit.</a> Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).</li><li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+lipid+accumulation,+lipoprotein+oxidation,+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish.">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+effects+of+high-carbohydrate+feeding+of+larvae+on+adult+glucose+metabolism+in+zebrafish,+Danio+rerio.">Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio.</a> Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).</li><li>Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+combined+high+cholesterol+diet+and+high+glucose+environment+on+vasculature.">Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature.</a> PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+and+attenuation+of+oxidized+lipid+accumulation+in+hypercholesterolemic+zebrafish.">In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation.">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Matthews, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha-dependent+hepatic+steatosis+and+liver+degeneration+caused+by+mutation+of+zebrafish+S-adenosylhomocysteine+hydrolase.">TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase.</a> Development. 136 (5), 865-875 (2009).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10, 21 (2010).</li><li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish.">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).</li><li>Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+approaches+to+the+study+of+zebrafish+nutrition.">Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition.</a> ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).</li><li>Farber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+digestive+physiology+using+fluorescent+phospholipid+reporters.">Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters.</a> Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).</li><li>Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+yolk+lipid+processing:+a+tractable+tool+for+the+study+of+vertebrate+lipid+transport+and+metabolism.">Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).</li><li>Otis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+apolipoprotein+biology:+comprehensive+expression+analysis+and+a+role+for+ApoA-IV+in+regulating+food+intake.">Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).</li><li>Bligh, E., Dyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).</li><li>Otis, J. P., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism.">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li><li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis.">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le tecniche qui descritte permettono ai ricercatori di trattare zebrafish larvale con mangimi ricchi di lipidi, visualizzare trasformazione dei lipidi nella dieta in larve vive, e quantificare l&#39;assunzione di cibo larvale. Per garantire il successo, particolare attenzione deve essere data a diversi passaggi critici. uova di gallina commerciali variano; Per minimizzare la variabilità potenziale eseguiamo tutti i saggi su uova biologiche da polli privi di gabbia che non sono stati arricchiti per gli acidi grassi omeg...

I meccanismi mediante i quali l&#39;intestino regola l&#39;elaborazione lipidico dietetico, fegato controlla complesso metabolismo sintesi dei lipidi e lipoproteine, e come questi organi funzionano con il sistema nervoso centrale per controllare l&#39;assunzione di cibo non sono completamente compresi. È di interesse biomedico per chiarire questo biologia alla luce delle epidemie attuali di obesità, malattie cardiovascolari, diabete e malattie del fegato grasso non-alcolica. Studi in colture cellulari e topi hanno fornito la maggior parte della nostra comprensione delle relazioni meccanicistiche tra lipidi alimentari e malattie, e zebrafish (Danio rerio) stanno emergendo come un modello ideale per completare questo lavoro. Zebrafish hanno gastrointestinale simile (GI) gli organi, il metabolismo dei lipidi, e il trasporto delle lipoproteine a vertebrati superiori a 1,2, si sviluppano rapidamente, e sono geneticamente trattabili. La chiarezza ottica del pesce zebra larvale facilita studi in vivo, una particulaR vantaggio per lo studio del sistema gastrointestinale come il suo ambiente extracellulare (vale a dire, la bile, microbiota, endocrino segnalazione) è praticamente impossibile per modellare ex vivo. In accordo, un corpo di ricerca che unisce la trattabilità genetica e conduciveness di vivere l&#39;imaging di larve di zebrafish con una varietà di manipolazioni dietetiche (alto contenuto di grassi, 3,4 -cholesterol 5, e diete -carbohydrate 6,7), e modelli di malattia cardiovascolare 8, diabete 9,10, steatosi epatica 11-13, 14-16 e l&#39;obesità, stanno emergendo per fornire una serie di approfondimenti metabolici. Un aspetto essenziale della transizione del pesce zebra larvale nella ricerca metabolica è l&#39;ottimizzazione delle tecniche sviluppate in altri animali modello per il pesce zebra e lo sviluppo di nuovi test che sfruttano i punti di forza del pesce zebra. Questo protocollo presenta le tecniche sviluppati e ottimizzati per alimentare zebrafish larvale un Lipiricco d-pasto, visualizzare trasformazione alimentare di lipidi da tutto il corpo per la risoluzione subcellulare, e misurare l&#39;assunzione di cibo. tuorlo d&#39;uovo di gallina è stato scelto per comporre il pasto ricco di lipidi in quanto contiene livelli elevati di grassi e colesterolo (lipidi compongono ~ 58% di tuorlo d&#39;uovo di gallina, di cui ~ 5% è il colesterolo, il 60% sono i trigliceridi, e il 35% sono fosfolipidi ). Tuorlo d&#39;uovo di gallina fornisce più grasso di prodotti tipici commerciali zebrafish micropellet (~ 15% di lipidi) e il vantaggio che si tratta di un feed standardizzato con percentuali note di specifiche specie di acidi grassi, come le diete zebrafish e reggimenti di alimentazione non sono stati standardizzati attraverso laboratori 17. Inoltre, analoghi lipidici fluorescenti fornite nel tuorlo d&#39;uovo visualizzare trasporto e accumulo di lipidi alimentari 18, componenti cellulari di immagine tra goccioline lipidiche agendo sia coloranti vitali 3 e attraverso covalente incorporazione in lipidi complessi, indagare metabolismo attraverso cromatografia su strato sottile (TLC) 19 </sup&gt; E la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (SAF dati non pubblicati), e di fornire un metodo quantitativo per una totale assunzione di cibo 20.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anesthesia for larval zebrafish</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor 3000 sonicator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Sonabox acoustic enclosure</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; tapered microtip</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Amber vials (4 ml, glass)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&amp;nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Incubated shaker for feeds</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td></tr><tr><td>TopFluor cholesterol&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>For TopFluor cholesterol solubilization</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR microscope slides&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Cover Glass</td><td>12-544A</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>FluoroDish (glass bottom dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscope for high magnification live imaging</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscope for low magnification live imaging</td></tr><tr><td>Glass culture tubes&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&amp;nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipid extraction</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analysis of food intake assay</td></tr><tr><td>5 3/4&amp;rsquo; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Transfering larvae</td></tr></tbody></table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

Quando alimentato su una sedia a dondolo a 29-31 ° C, la maggior parte delle larve sane (≥95%) si mangia entro 1 ora. Al momento di consumare l&#39;emulsione di tuorlo d&#39;uovo, l&#39;intestino delle larve scurisce a colori. Molto intestini scuri possono essere osservati a 2 ore (Figura 1). Se larve sono digiuni o non vengono alimentate, l&#39;intestino rimane chiaro. Le larve d&#39;uovo alimentato mostra bianco un dilatate lume intestinale che non oscurano a colori. <p class="jove_content" fo:...

Watch this Scientific Journal Video about High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake at JoVE.com

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

Video: High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Ricerca

Ambiente

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Ricerca sul cancro

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neuroscienze

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Biologia dello sviluppo

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage di larve Zebrafish

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Biologia

Analisi della contrazione cardiaca del pesce zebra con l'interazione della realtà virtuale

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Autore in primo piano: Imaging 4D Light-Sheet ad alta risoluzione e realtà virtuale in zebrafish per l'analisi di singole cellule della funzione cardiaca

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Bioingegneria

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l'imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Microgavage di larve Zebrafish

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

High Throughput