1. La Thermo Scientific Solaris qPCR analisi la progettazione di algoritmi <ol><li> L&#39;algoritmo utilizzato nella progettazione di Solaris qPCR sonda / primer coppie regola la Tm di ogni componente consentendo in tal modo condizioni di ciclismo universale. Scanalatura incorporazione della MGB, o minore vincolante, molecola nella sonda aumenta il Tm e permette di brevi sonde devono essere progettati per una maggiore flessibilità di analisi e prestazioni. Come il loro nome, MGBs sono una classe di antibiotici che possono adattarsi al solco minore della doppia elica del DNA. MGBs sono attaccati fino alla fine 3 o 5 di una sonda di DNA. In soluzione, la fluorescenza giornalista FAM della sonda si spegne da Quencher Eclipse Oscuro. Quando la sonda si lega ad una sequenza bersaglio, con conseguente cambiamento di sonda s 3-D conformazione permette un forte segnale fluorescente. Legame della sonda alla sequenza del DNA bersaglio è stabilizzata dal MGB, che consente l&#39;utilizzo di altamente specifico, sonde brevi mantenendo la temperatura adeguata di fusione per la PCR. Così, il rilevamento del segnale si verifica durante la fase di ricottura di amplificazione di destinazione. Durante la fase di estensione, la sonda MGB dissocia e la fluorescenza è di nuovo spenta. Poiché la sonda dissocia, non influenza l&#39;efficienza della PCR. </li><li> Un&#39;altra caratteristica dell&#39;algoritmo Solaris è l&#39;uso di Superbases. Superbases vengono modificati basi che hanno migliorato le capacità vincolante per migliorare la stabilità di AT titoli ed eliminare GG auto-associazione di sequenze ricche in guanina. Inoltre, non spegnere fluorofori adiacente attaccato al capolinea 5. Queste basi sono selettivamente posto, secondo l&#39;algoritmo, per ampliare la disponibilità di sequenze bersaglio. Questo rende possibile l&#39;utilizzo di sequenze, come le regioni ricche in GC, che altrimenti sarebbero evitati nella progettazione di primer e sonde. </li><li> Quando possibile, l&#39;algoritmo di Solaris incorpora regioni di giunzione esone estende nel sito di destinazione. Questo aumenta la specificità, evitando l&#39;amplificazione del DNA genomico contaminante. </li><li> È importante sottolineare che l&#39;algoritmo individua inoltre una sequenza consenso per tutte le varianti di splicing conosciuti, in modo tale che tutti sono coperti da una singola sonda / set primer. Quindi, solo un test è necessario per un particolare gene di interesse. </li><li> Infine, il saggio di Solaris qPCR algoritmo design utilizza dei parametri molto rigorosi per considerazioni di progettazione critici compresi i contenuti GC, lunghezza, Tm, e tratti di nucleotidi omogenea. Le sequenze risultanti sono BLAST analizzati per specificità utilizzando 3 diversi database: genomica, trascrizione, e pseudogene. </li></ol> 2. Ottenere Reagenti Solaris <ol><li> Per ottenere il appropriati reagenti Solaris, visitare <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Una volta sul sito clicca su &quot;Ricerca prodotti GENEius&quot;. Per andare direttamente alla ricerca dei prodotti GENEius, andare a <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Fare clic nella casella richiesta di ricerca e scegliere l&#39;organismo di destinazione appropriata. </li><li> La ricerca dei prodotti GENEius in grado di elaborare molti geni diversi identificativi. Qui, inserire uno dei termini di ricerca ha suggerito di trovare il gene di interesse, tra cui Rif. Seq adesione, l&#39;ID del gene, la sigla del gene, una descrizione Gene, l&#39;ID o il numero di Sanger di adesione, o un numero di catalogo. Quindi, fare clic su &quot;Cerca&quot;. </li><li> Identificare il gene di interesse e cliccare su &quot;Seleziona&quot; sul lato sinistro. Si aprirà una finestra che mostra i diversi prodotti Thermo Scientific disponibile per il gene di interesse. Nella sezione &quot;Prodotti&quot; selezionare l&#39;opzione &quot;Rilevazione qPCR&quot; Tab. </li><li> Sotto il &quot;Saggio di espressione genica Solaris&quot; voce, vedrete uno ottimamente progettato Solaris sonda / test primer. Questo saggio sarà coprire tutte le varianti di splicing note del gene bersaglio. Scegli la quantità desiderata. Sono disponibili in 100, 200, 400 e 1000 X 25 microlitri reazioni (se il test è identificato come made-to-order, i 100 confezioni non saranno disponibili). Clicca su &quot;Aggiungi al carrello&quot;. </li><li> Quindi, selezionare la combinazione appropriata master per il termociclatore che verrà utilizzato. Per determinare quale master mix funzionano meglio con la macchina a disposizione, clicca su &quot;Scopri quali Master Mix funziona meglio con il vostro Cycler PCR!&quot; </li><li> Trova la cycler qPCR che verrà utilizzato nel menu per determinare quale mix da usare. </li><li> Tornare alla finestra di ricerca dei prodotti GENEius, e selezionare il mix appropriato master. Il master mix è disponibile in 100, 200, 400 e 1000 misure di reazione. Fare clic su &quot;Aggiungi al carrello&quot;. </li><li> Geni di riferimento proposti e kit di sintesi verso cDNA possono essere ordinati anche per un completo qRT-PCR. </li><li> Quando i reagenti qPCR Solaris arrivare, conservarli a -20 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. I seguenti reagenti devono essere ricevuti: A 20X soluzione contenente due primer fornito a 800 nm ciascuno e una sonda gene specifico fornito a 200 nm, sequinformazioni di riferimento sia per la sonda e il primer, e Solaris Mix Gene qPCR Espressione Maestro ad una concentrazione 2X. Solaris qPCR saggi di espressione genica sono stabili per un minimo di 12 mesi. Evitare di congelare e scongelare ripetuti. </li></ol> 3. qPCR configurazione <ol><li> Iniziare il protocollo qPCR con cDNA. L&#39;RNA totale dovrebbe essere estratti utilizzando un metodo di colonna. La Thermo Scientific kit di sintesi Verso cDNA è raccomandato per la trascrizione inversa per generare cDNA. </li><li> Preparati per qPCR da scongelamento del primer, sonde e master mix su ghiaccio. Anche avere a disposizione acqua di qualità PCR e opaco qPCR piatti bianchi, che può migliorare la sensibilità di PCR in tempo reale. </li><li> Il master mix contiene tutti i componenti per PCR in tempo reale tra cui: 1) Termo-Start DNA polimerasi, un hot-start versione di DNA polimerasi Thermoprime. Questo tipo di polimerasi è usato per prevenire le non-specifica amplificazione durante la reazione di set-up e richiede fase di attivazione a 95 ° C 15 min. 2) dNTP nel mix Solaris Maestro, dTTP sostituisce dUTP per massimizzare l&#39;efficienza dell&#39;amplificazione 3) tampone di reazione di proprietà, ottimizzato per lavorare con Solaris primer / sonda test. Questo tampone di reazione contiene colorante blu per aumentare il contrasto tra il reagente e plastica. 4) ROX, se il vostro strumento qPCR richiede ROX. </li><li> Una volta che le soluzioni sono scongelati, mescolare sfogliando il tubo (non vortex). Spin giù per evitare perdite di reagente. </li><li> Successivamente, preparare una provetta sterile 15 ml Falcon per impostare la miscela di reazione per il gene di interesse, più uno per il gene di riferimento, scaling up a seconda del numero di campioni. Preparare sufficiente tale che tre repliche possono essere preparati per ogni campione, tra cui un modello di alcun controllo (NTC) e campioni curva standard, se il metodo di curva standard verrà utilizzato per l&#39;analisi. </li><li> Per ogni campione eseguito su una piastra da 96 pozzetti, mescolare i seguenti: 5 ml di Mix Solaris 2X qPCR Maestro, 0,5 l di Primer / sonda di Solaris (20X), e l&#39;acqua PCR grado tale che il volume di reazione finale, una volta il cDNA viene aggiunta saranno 25 microlitri. Per ogni campione eseguito su un piatto ben 384 mescolare le seguenti: 12,5 ml di Mix Solaris 2X qPCR Maestro, 1,25 l di Primer / sonda di Solaris (20X), e l&#39;acqua PCR grado tale che il volume di reazione finale, una volta che il cDNA si aggiunge saranno 10 L. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire il master mix nei rispettivi pozzetti della piastra. Il colorante blu inclusi nel master mix sarà di aiuto in corso pipettaggio monitoraggio sui piatti bianchi. Quindi, aggiungere il modello 1-5 microlitri cDNA (per una piastra 96 ​​pozzetti) o 1-2 ml di modello di cDNA (per un piatto ben 384). Pipetta su e giù per mescolare. Porre la piastra in una centrifuga e spin giù per rimuovere eventuali bolle, in quanto questi interferiscono con le letture fluorescenza. </li><li> Programmare il termociclatore: L&#39;enzima deve essere attivato con un 95 ° C 15 minuti (1 ciclo). Poi 40 cicli di 95 ° C, denaturazione per 15 secondi, e la ricottura e l&#39;estensione a 60 ° C per 60 secondi. </li><li> Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Avviare il programma. </li></ol> Rappresentante risultati qPCR con Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Test Solaris dare un rilevamento affidabile anche a concentrazioni molto basse di ingresso, a giudizio l&#39;efficienza della PCR e dei valori r2. Dieci 10-diluizioni di cDNA sintetizzato da sintetici sequenza amplicone RNA o amplicon sequenza di DNA è stato amplificato su uno strumento ABI 7900HT utilizza Solaris saggio qPCR espressione genica per F2RL1 o CDC20, rispettivamente. Il registro su scala curve di amplificazione e curve standard sono indicati con le prestazioni di ciascun saggio tra cui l&#39;efficienza, il valore r2, gamma dinamica su 10 log10 diluizioni, e il limite inferiore di rilevamento. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Saggi Solaris dare risultati consistenti anche tra diversi ricercatori e laboratori. siRNA targeting ALDOA e PPIB, così come un controllo non-targeting (NTC), sono state trasfettate in cellule HeLa a nM 100, 10, 1 e 0,1 concentrazioni finali. Le cellule sono state raccolte e RNA totale isolato 48 ore post-trattamento. cDNA è stato sintetizzato con Thermo Scientific cDNA Synthesis Kit Verso. Un&#39;aliquota del cDNA è stato amplificato in due laboratori geograficamente separati usando Solaris qPCR saggi di espressione genica per il rilevamento di ALDOA, PPIB, e GAPDH su un LightCycler Roche 480 (384 pozzetti) piattaforma. Knockdown è stato calcolato con il metodo ΔΔCq (normalizzata a GAPDH di riferimento dei geni e cellule trattate con NTC). Gli stessi livelli di knockdown sono state dimostrate per entrambi i target genico tra le due ricercatori in entrambi i siti.

Gli autori di questo articolo sono dipendenti di Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris saggi qPCR forniscono un metodo semplice e migliore per l&#39;esecuzione di analisi qPCR. Utilizzando un algoritmo di alto rigore, incorporando la tecnologia e MGB Superbases, questi set di primer e sonda massimizzare la fedeltà e la robustezza degli esperimenti qPCR. Un set di primer e sonda riconosce tutte le varianti di splicing nota di un dato gene. Il sito di destinazione, quando possibile, comprende le regioni esone spanning, per garantire che il DNA genomico non è amplificato. Queste caratteristiche permettono di eseguire numerosi campioni contemporaneamente, riducendo notevolmente la quantità di tempo necessario per eseguire esperimenti complessi. Poiché il master mix è blu, è possibile utilizzare piatti bianchi opachi, che migliorano la sensibilità del qPCR, senza perdere di pipettaggio. Presi tutti insieme, le caratteristiche di progettazione del saggio Solaris qPCR rendono questo saggio qPCR romanzo un test semplice, ma ad alte prestazioni che è specifica e robusto.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Il gene Solaris qPCR analisi di espressione è un nuovo tipo di primer / sonda set, progettato per semplificare il processo di qPCR pur mantenendo la sensibilità e la precisione del dosaggio. Questi primer / probe set sono già progettati per&gt; 98% del genoma umano e del mouse e miglioramenti caratteristica significativa dalle tecnologie disponibili in precedenza. Questi miglioramenti sono stati resi possibili in virtù di un algoritmo di design innovativo, sviluppato da Thermo Scientific esperti di bioinformatica. Diverse funzioni utili sono state incorporate nel saggio Solaris qPCR per snellire il processo di esecuzione quantitativa real-time PCR. In primo luogo, il protocollo è simile a quello comunemente impiegato alternative, per cui i metodi utilizzati durante qPCR sono suscettibili di essere a conoscenza. In secondo luogo, la master mix è blu, il che rende l&#39;impostazione delle reazioni qPCR più facile da monitorare. In terzo luogo, le condizioni cicli termici sono gli stessi per tutte le analisi (geni), che consente di eseguire molti campioni alla volta e riducendo il rischio di errore. Infine, la sonda e la sequenza di innesco informazioni vengono fornite, semplificando il processo di pubblicazione. Qui, dimostriamo come ottenere i reagenti appropriati di Solaris utilizzando la funzione di ricerca GENEius prodotto trovato sul sito web di ordinazione (www.thermo.com / Solaris) e come utilizzare i reagenti per l&#39;esecuzione di Solaris qPCR usando il metodo standard di curva.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Il Solaris qPCR saggi di espressione genica sono nuovi pre-progettati qPCR primer / sonda combinazioni progettato per semplificare il processo di qPCR senza sacrificare la specificità e la robustezza del test.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K Views.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Ambiente

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicina

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Immunologia e infezioni

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biologia

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona 
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also known as real-time PCR, is a widely-used molecular technique for enumerating microorganisms in the environment. Prior to this approach, quantifying microorganisms was limited largely to classical culture-based techniques. However, the culturing of microbes from environmental samples can be particularly challenging, and it is generally held that as few as 1 to 10% of the microorganisms present within environmental samples are detectable using these techniques. The advent of qPCR in environmental microbiology research has therefore advanced the field greatly by allowing for more accurate determination of concentrations of microorganisms such as disease-causing pathogens in environmental samples. However, an important limitation of qPCR as an applied microbiological technique is that living, viable populations cannot be differentiated from inactive or non-living populations.
This video demonstrates the use of qPCR to detect pepper mild mottle virus from an environmental water sample.

Quantificazione di microrganismi e virus ambientali mediante qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...