1. Thermo Scientific Solaris qPCR Testi Tasarım Algoritma <ol><li> Solaris qPCR prob / primer çiftleri tasarımında kullanılan algoritma ve böylece evrensel bisiklet koşulları sağlayan her bir bileşenin Tm ayarlar. MGB Ortaklık veya küçük oluk bağlama, prob içinde benzer parçaları Tm artırır ve daha fazla tahlil esneklik ve performans için tasarlanmış gibi kısa probları olanak sağlar. Kendi adından da anlaşılacağı gibi, MGBs DNA sarmalını küçük oluk içine sığabilecek bir sınıf antibiyotiklerin. MGBs bir DNA prob sonuna kadar 3 ya da 5 bağlıdırlar. Çözüm, probun FAM muhabiri floresan Eclipse Dark Quencher ile söndürülür. Prob hedef dizisine bağlanır, prob 3-D yapısındaki değişimin güçlü bir floresan sinyal sağlar. DNA prob hedef sırasına Cilt PCR için uygun erime sıcaklığını korurken, son derece özel, kısa probları kullanımına izin verir MGB tarafından stabilize edilir. Böylece, sinyal algılama hedef amplifikasyon tavlama aşamasında oluşur. MGB prob disassociates uzatma adım sırasında, floresan tekrar söndürülür. Prob kesilir, çünkü PCR verimliliği etkilemez. </li><li> Solaris algoritması bir başka özelliği kullanımı Superbases. Superbases bağlar AT istikrarı geliştirmek ve GG guanin zengin dizileri kendine dernek ortadan kaldırmak için bağlayıcı yetenekleri gelişmiş üsler modifiye edilmiştir. Ayrıca, 5 terminus bağlı bitişik fluorophores söndürmeyecek. Bu bazlar hedef dizilerinin kullanılabilirliğini genişletmek için, seçici algoritmasına göre yerleştirilir. Bu mümkün aksi astar ve sondalar tasarımı önlenmiş olur GC zengin bölgeler olarak dizileri, kullanımı mümkün kılar. </li><li> Mümkün olduğunca, Solaris algoritması, hedef site ekzon kavşağı kapsayan bölgelerde içermektedir. Bu kirletici genomik DNA amplifikasyon kaçınarak özgüllük artar. </li><li> Önemlisi, algoritma, aynı zamanda tek bir prob / astar seti ile kaplı olduğu gibi, bilinen tüm ek varyasyonları için bir konsensüs dizisi, tanımlar. Yani, sadece bir testi ilgi belirli bir gen için ihtiyaç vardır. </li><li> Son olarak, Solaris qPCR Testi tasarım algoritması GC içeriği, uzunluğu, Tm, ve homojen nükleotidlerin uzanan dahil olmak üzere, kritik tasarım konuları için çok sıkı parametreleri kullanır. Genomik, transkript, pseudogene: sonuçlanan dizileri analiz özgüllük için 3 farklı veritabanları kullanılarak BLAST. </li></ol> 2. Solaris Reaktifler Alınması <ol><li> Uygun Solaris reaktifleri elde etmek için, ziyaret <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Bir kez web sitesinde &quot;GENEius Ürün Arama&quot; üzerine tıklayın. GENEius ürün arama doğrudan gitmek için, gitmek <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Sorgulama, arama kutusuna tıklayın ve uygun bir hedef organizma seçin. </li><li> GENEius ürün arama, birçok farklı gen tanımlayıcıları işleyebilir. Burada, Ref Seq Katılım, Gen kimliği, Gen Sembol, Gen Açıklama, Sanger kimliği veya Katılım sayısı, ya da bir katalog numarası da dahil olmak üzere ilgi geni bulmak için önerilen Arama terimlerinizi girin. Daha sonra, &quot;Ara&quot; tıklayın. </li><li> Ilgi gen belirlenmesi ve sol tarafta &quot;Select&quot; tıklayın. Bu ilgi gen farklı Thermo Scientific ürünleri gösteren bir pencere açılacaktır. &quot;Ürünler&quot; başlığı altında &quot;qPCR Algılama&quot; sekmesini seçin. </li><li> Başlığı &quot;Solaris Gen İfadesi Testi&quot; altında, bir optimal Solaris prob / astar tahlil tasarlanmış göreceksiniz. Bu bir testi gen hedef bilinen tüm splice varyantları kapsayacaktır. Istenilen miktar seçin. 100, 200, 400 mevcuttur ve 1000 X 25 ul reaksiyonlar (tahlil için sipariş olarak tespit ise, 100 paket boyutu mümkün olmayacaktır). &quot;Sepete Ekle&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Daha sonra, kullanılacak olan termal cycler için uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı makine ile mevcut olan en iyi çalışacak belirlemek için, tıklayın &quot;Master Mix PCR Cycler ile en iyi çalıştığını öğrenin!&quot; </li><li> Menü kullanımı hangi karışımı belirlemek için kullanılan olacak qPCR cycler bul. </li><li> GENEius ürün arama penceresine geri dönün ve uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı, 100, 200, 400, ve 1000 reaksiyon boyutları gelmektedir. &quot;Sepete Ekle&quot; yi tıklatın. </li><li> Önerilen referans genler ve verso cDNA sentezi kitleri de tam bir QRT-PCR analizi için sipariş edilebilir. </li><li> Solaris qPCR reaktifler geldiğinizde, kullanıma hazır olana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. Aşağıdaki reaktifler alınan olmalıdır: 200 nm, sequ sağlanan her bir gen spesifik prob 800 nM iki primer içeren 20X çözümprob ve primerler ve 2X bir konsantrasyonda Solaris qPCR Gen İfadesi Master Mix için referans bilgileri. Solaris qPCR Gen İfade Tahliller en az 12 ay boyunca stabildir. Tekrarlanan dondurulmasından kaçının. </li></ol> 3. qPCR kurulum <ol><li> QPCR protokolü cDNA ile başlayın. Toplam RNA bir spin kolon yöntemi ile elde edilmelidir. Thermo Scientific Verso cDNA sentezi kiti cDNA oluşturmak için ters transkripsiyon için tavsiye edilir. </li><li> Astar, sondalar, çözülme ve buz üzerinde ana karışımı qPCR için hazırlayın. Ayrıca yanda PCR sınıf su ve real-time PCR hassasiyeti artırabilir, opak beyaz qPCR tabak, var. </li><li> 1) Thermo-Başlangıç ​​DNA polimeraz, Thermoprime DNA polimeraz sıcak bir başlangıç ​​sürümü: master karışımı da dahil olmak üzere, gerçek zamanlı PCR tüm bileşenleri içerir. Bu tür polimeraz reaksiyon ayarlamak sırasında non-spesifik amplifikasyon önlemek için kullanılan ve Etkinleştirme adımını 95 ° C&#39;de 15 dakika gerektirir. 2) Solaris Master karışımı dNTP dTTP Solaris astar / sonda deneyleri ile çalışmak üzere optimize Tescilli reaksiyon tamponu amplifikasyon verimliliğini 3), en üst düzeye çıkarmak için dUTP yerini almıştır. Bu reaksiyon tamponu, reaktif ve plastik arasındaki kontrastı arttırmak için mavi boya içerir. 4) ROX qPCR araç gerektiriyorsa ROX. </li><li> Çözümleri çözülmüş sonra, tüp (vorteks) hafifçe vurarak karıştırın. Reaktif kaybını önlemek için onları aşağı spin. </li><li> Sonra, numune sayısına göre ölçekleme ilgi gen, artı için bir referans gen, reaksiyon karışımı kurmak için 15 ml steril Falcon tüp hazırlar. Üç analiz için standart eğri yöntemi kullanılacaksa, bir şablon kontrolü (NTC) ve standart eğri örnekleri de dahil olmak üzere, her bir örnek için hazırlanmış olabilir çoğaltır öyle ki yeterli hazırlayın. </li><li> 96 plaka üzerinde çalışan her bir örnek için, aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 5 mcL, 0,5 Solaris Primer / Prob seti (20X) ul, ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 25 mcL olacak eklenir. 384 plaka üzerinde çalışan her bir numune için aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 12.5 mcL, Solaris Primer / Prob seti (20x) 1.25 ul ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 10 mcL eklenir olacaktır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plaka uygun kuyular için ana karışımı aktarın. Master miks içerisinde yer alan mavi boya beyaz tabak izleme pipetleme ilerleme yardımcı olacaktır. Ardından, 1-5 mcL cDNA şablon (96 plaka için) veya cDNA şablonu 1-2 mcL (384 plaka) ekleyin. Karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Santrifüj plaka koyun ve bu floresan okumaları ile engel olacak şekilde, herhangi bir kabarcıkları aşağı doğru döndürün. </li><li> Program termal cycler: enzimi ile aktive edilmelidir 95 ° C 15 dakika (1 döngü). Sonra 40 döngü 95 ° C, 15 saniye denatürasyon, tavlama ve uzatma, 60 ° C 60 saniye boyunca. </li><li> QPCR araç plaka yerleştirin. Programı başlatın. </li></ol> Solaris kullanarak Temsilcisi qPCR sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. PCR verimliliği ve r2 değerleri tarafından değerlendirilecek Solaris testleri, çok düşük girdi konsantrasyonlarda bile güvenilir şekilde algılanmasını sağlar . Sentetik RNA Amplikon dizisi veya DNA Amplikon dizisi sentezlenen cDNA On 10 kat dilüsyonlarının sırasıyla F2RL1 veya CDC20, Solaris qPCR Gen İfade Testi kullanarak bir ABI 7900HT enstrüman güçlendirildi. Log-ölçek büyütme eğrileri ve standart eğrileri, verimliliği, r2 değeri, 10 log10 dilüsyonları dinamik aralık ve algılama alt sınırı da dahil olmak üzere her bir testin performansı ile birlikte gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Solaris Tahliller hatta farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında tutarlı sonuçlar verir. ALDOA ve PPIB yanı sıra hedefleme Kontrolü (NTC) hedefleyen siRNA&#39;lar, 100, 10, 1 ve 0.1 nM son konsantrasyonları HeLa hücrelerine transfekte edildi. Hücreler hasat ve 48 saat tedavi sonrası total RNA izole edildi. Thermo Scientific Verso cDNA Sentezi Kit kullanılarak cDNA sentezlendi. Roche LightCycler 480 (384-iyi) platformu üzerinde Solaris qPCR Gen İfade Tahliller ALDOA, PPIB ve GAPDH tespiti için coğrafi olarak ayrılmış iki laboratuvarlarda cDNA bir kısım güçlendirildi. Demonte ΔΔCq (GAPDH referans gen ve NTC-tedavili hücrelerde normalize) yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Demonte ile aynı düzeyde, hem de araştırmacılar her iki site arasındaki gen hedefleri hem için gösterildi.

Bu makalenin yazarları, Thermo Scientific çalışanları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Tahliller qPCR analiz yapmak için basit, gelişmiş bir yöntem sağlar. MGB teknolojisi ve Superbases içeren, yüksek darlığı algoritması kullanarak, bu astar ve prob setleri qPCR deneylerin doğruluk ve sağlamlık en üst düzeye çıkarmak. Bir astar ve prob seti, belirli bir gen bilinen tüm ek varyantları tanır. Hedef site, mümkün olduğunca bu genomik DNA amplifiye değildir sağlamak için ekzon kapsayan bölgeler, içerir. Bu özellikler mümkün karmaşık deneyler gerçekleştirmek için gereken zaman miktarını büyük ölçüde azaltarak, aynı anda çok sayıda örnekleri çalıştırmak için. Ana karışımı mavi olduğundan, beyaz opak pipetleme takip kaybetmeden, qPCR duyarlılığını artırmak tabak, kullanmak mümkündür. Hep birlikte ele alındığında, Solaris qPCR Testi tasarım özellikleri bu romanı qPCR tahlil, hem özel ve hem de sağlam bir yüksek performanslı, henüz basit bir tahlil yapmak.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Solaris qPCR Gen İfade Testi, testin duyarlılığı ve hassasiyeti korurken qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış primer / prob seti bir roman türüdür. Bu primer / prob setleri&gt;% 98, daha önce mevcut teknolojilerin insan ve fare genomlarından ve özellik önemli iyileştirmeler için önceden tasarlanmış. Bu gelişmeler Thermo Scientific biyoinformatik uzmanları tarafından geliştirilen yeni tasarım algoritması sayesinde mümkün olmuştur. Birçok kullanışlı özellikleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR performans sürecini kolaylaştırmak için Solaris qPCR Testi içine dahil edilmiştir. İlk olarak, protokol sık istihdam alternatifleri benzer, bu yüzden qPCR sırasında kullanılan yöntemleri aşina olmak için muhtemeldir. İkinci olarak, ana karışımı, mavi izlemek için qPCR reaksiyonlar daha kolay ayar yapar. Üçüncü olarak, termal döngü koşulları mümkün bir anda birçok örnekleri çalıştırmak ve hata potansiyelini azaltarak, (genler), tüm testleri için aynıdır. Son olarak, prob ve primer sırası bilgilerinin, yayın sürecinin basitleştirilmesi sağlanır. Burada, sipariş web sitesi (www.thermo.com / solaris) ve standart eğri yöntemi kullanılarak qPCR gerçekleştirmek için Solaris reaktifleri kullanmak bulundu GENEius ürün arama özelliğini kullanarak uygun Solaris reaktifleri elde etmek için nasıl gösterilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solaris qPCR Gen İfadesi Tahlilleri testinin özgüllük ve sağlamlık ödün vermeden qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış yeni önceden tasarlanmış qPCR primer / prob kombinasyonları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K Görüntüleme.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Kanser Araştırmaları

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

Toprak kaynaklı Phytopathogens bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak yerinde moleküler tespiti

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Çevre

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Tıp

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biyoloji

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona 
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also known as real-time PCR, is a widely-used molecular technique for enumerating microorganisms in the environment. Prior to this approach, quantifying microorganisms was limited largely to classical culture-based techniques. However, the culturing of microbes from environmental samples can be particularly challenging, and it is generally held that as few as 1 to 10% of the microorganisms present within environmental samples are detectable using these techniques. The advent of qPCR in environmental microbiology research has therefore advanced the field greatly by allowing for more accurate determination of concentrations of microorganisms such as disease-causing pathogens in environmental samples. However, an important limitation of qPCR as an applied microbiological technique is that living, viable populations cannot be differentiated from inactive or non-living populations.
This video demonstrates the use of qPCR to detect pepper mild mottle virus from an environmental water sample.

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler