Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Science Foundation sovvenzione MCB-0718846 e della Difesa Advanced Research Projects Agency Contratto N66001-12-C-4020 (per JDB). LAM è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. La pubblicazione di questo articolo è sponsorizzato da Roche.

1. Preparare lievito DNA genomico (gDNA) <ol><li> Preparare uno stock di lievito Lysis Buffer 9 contenente 50 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Come iniziare Uso dei materiali ~ 2 x 10 6 cellule, che corrisponde in genere a ~ 100 ml di cultura satura per i ceppi di laboratorio del 10 BY4741 sfondo. Cellule coltivate devono essere raccolte mediante centrifugazione a 1000 xg per 3 min a temperatura ambiente in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 ml di lievito Lysis Buffer e risospendere il pellet cellulare pipettando. </li><li> Aggiungere ~ 300 microlitri di acido lavato perle di vetro tale che il livello di perline è di circa 1 mm al di sotto del livello della sospensione cellulare. </li><li> In una cappa aspirante aggiungere 200 ml di fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (25: 24: 1). Tappare la provetta per microcentrifuga e accertarsi che non perle sono bloccati tra il tappo e il tubo come questo si tradurrà in perdite durante l&#39;agitazione(Passo 1.6). Invertire 3 volte per mescolare e verificare il tappo è sigillata. </li><li> Agitare la provetta per 10 min a temperatura ambiente utilizzando un mixer da banco come un Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugare a 20.800 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferimento 75 ml di fase acquosa in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1 ml di etanolo al 100%. Invertire 10 volte per mescolare. </li><li> Pellet il DNA mediante centrifugazione a 20.800 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare a 20.800 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA e aria asciugare il pellet con il tappo microcentrifuga aperto fino eccesso di etanolo evaporato, che di solito è di circa 10 min. </li><li> Risospendere il pellet di DNA in 75 ml di 10mM Tris pH 7.4 e agitare per miscelare. Conservare il campione a -20 ° C tempo indeterminato. Misurare la concentrazione di DNA nel campione utilizzando unBenchtop fluorimetro quali qubit, che distingue DNA da RNA. Assicurarsi che la concentrazione finale di gDNA è ~ 1-2 ng / ml. </li><li> Preparare una diluizione 1:10 di DNA genomico con acqua e agitare per miscelare. </li><li> Aliquotare 30 ml di gDNA diluito nel pozzetto di una piastra appropriata fonte che è compatibile con un dosatore acustica nanoscala (passaggio 3). Se si utilizza un Labcyte Echo 550, utilizzare una piastra in polipropilene 384 bene (targa 384PP). NOTA: quando sigillato appropriatamente questo piatto può essere conservato per almeno un mese a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparare ed erogazione qPCR Master Mix in un piatto multiwell 1.536 <ol><li> Preparare 850 ml di qPCR master mix, come LightCycler 1536 DNA Verde Maestro, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. Centrifugare il master mix qPCR per 2 min a 20.800 xg a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle. I componenti della miscela master qPCR richiesto per una singola 1.536 piastra multipozzetto sono come seguonos: <ol><li> Combina 170 ml di master mix enzima (metropolitana di Green Master 1, 5x concentrato), 42,5 ml di SYBR (Verde Maestro Provetta 4, 20x concentrata) e 637,5 ml di acqua. </li></ol></li><li> Dispensare 500 nl / bene in un piatto di 1.536 pozzetti utilizzando un distributore di rinfuse liquide, come l&#39;Arte Robbins Cobra. (Si noti che i passaggi 2.2.1-2.2.4 si riferiscono specificamente al Cobra.) <ol><li> Creare un programma di erogazione con le seguenti impostazioni: classe liquido, acqua; il volume aspirato, 800 ml; erogare il volume, 500 nl; lavare il tempo, 20 sec. Nelle impostazioni di erogazione, verificare la velocità di erogazione è impostato al 49,6 mm / sec, l&#39;offset di erogazione è di 0,25 mm, liquido aspirato eccesso verrà erogata indietro nella fonte bene. </li><li> Posizionare il tubo microcentrifuga contenente la master mix qPCR in pozzetto A1 del titolare provetta per microcentrifuga, che si trova in posizione di ponte 1. Tagliare il tappo della provetta per microcentrifuga o semplicemente lasciarla aperta. Impostare il &#39;Aspirare bene&#39; per A1 modificando il AspiratImpostazioni e. </li><li> Eseguire una fase di lavaggio prima di erogare qPCR master mix per primo de-selezionando l&#39;aspirare e dispensare fasi del programma creato nel passo 2.2.2 e premendo &#39;run&#39;. Una volta completato, riselezionare la aspirare e dispensare passaggi prima di eseguire il programma completo per erogare qPCR master mix. Se il Cobra è stato inattivo per meno di 10 minuti la fase iniziale di lavaggio, che serve per innescare il sistema, non è necessaria. </li><li> Hit &#39;run&#39; di dispensare qPCR Master Mix per ogni bene. </li></ol></li><li> Raccogliere il master mix qPCR in fondo a ogni bene da breve centrifugazione del 1536 piastra di pozzetti (30 sec con una bassa velocità PCR piatto ogiva). </li></ol> 3. Dispensare Template DNA e Primer nel 1.536 pozzetti Piastra <ol><li> Erogare 5 nl di gDNA diluito (passo 1.3) nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l&#39;Echo 550. <ol><li> Per il Echo 550, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. Assicurarsi che la sorgente selezionata bene per il gDNA nel programma corrisponde alla fonte ben in cui si è fisicamente erogato il gDNA (passo 1,3). Scegliere la targhetta fonte &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, che indica il liquido nella piastra 384PP è un buffer senza tensioattivi. </li></ol></li><li> Erogare 10 nl di primer, pre-miscelati in avanti e inversa ad una concentrazione finale di 50 mM ciascuno, nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l&#39;Eco 550. <ol><li> Per il sistema di trasferimento di liquido, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. NOTA: Qui è possibile erogare primers tale che il layout sulla piastra multipozzetto 1.536 corrisponde all&#39;ordine cromosomico dei primer per cui è facile per ispezionare visivamente i risultati in tempo reale PCRsuccessivamente (fase 6). </li><li> Premiscelare i primer in una piastra che è compatibile con l&#39;erogatore liquido acustica. Per l&#39;Eco 550, utilizzare una piastra Labcyte 384LDV (volume morto) e scegliere il tipo di piatto di origine &#39;384LDV_AQ_B&#39; durante la programmazione l&#39;Eco per indicare il liquido è un semplice tampone senza proteine. </li></ol></li></ol> 4. Seal e Centrifuga 1536 pozzetti Piastra <ol><li> Utilizzando un sistema sigillante micropiastre come il Plateloc Microplate Sealer termica, sigillare immediatamente la piastra multipozzetto 1.536 utilizzando otticamente chiaro sigillo che è compatibile con lo strumento termosaldatrice. Non toccare la superficie della guarnizione per evitare delle macchie. <ol><li> Se si utilizza il Plateloc termica Microplate Sealer, utilizzare le seguenti impostazioni: sigillare tempo 2,0 sec, temperatura di saldatura 162 ° C, la pressione dell&#39;aria 82 psi. Questo strumento prende ~ 5 min a scaldarsi e quindi deve essere attivata in anticipo. </li><li> Se si utilizza il Plateloc micropiastre termico sigillante, un adapter deve essere utilizzato per aumentare l&#39;altezza del 1536 piastra multipozzetto sulla scena dello strumento per garantire una buona tenuta. NOTA: Anche se è preferibile acquistare un piattello per il Plateloc micropiastre termico sigillante, una soluzione alternativa è quella di inserire quattro ~ 2 mm di spessore rondelle standard disponibili in qualsiasi negozio di ferramenta negli angoli per aumentare l&#39;altezza della piastra pozzetti 1.536. </li></ol></li><li> Centrifugare immediatamente la piastra multipozzetto sigillato 1.536 a 2.000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere tutti i reagenti sul fondo di ciascun pozzetto. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programma uno strumento 1.536 qPCR, come il LightCycler 1536, con un protocollo di amplificazione due fasi seguita da una analisi della curva di fusione. Utilizzando il software LightCycler 1.536 istituito un programma come segue: <ol><li> Pre-incubazione: 95 ° C, 1 min di attesa, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessun acquisto. </li><li> Two Step Amplificazione: 30 cicli di [95 ° C, nessuna attesa,rampa tasso 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 64 ° C, 30 sec attesa, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, singola acquisizione]. </li><li> Melt curva: 95 ° C, 10 sec, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 60 ° C, 1 min, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione; 97 ° C, velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, 5 acquisizioni / ° C (continuo). </li><li> Raffreddare: 40 ° C, 30 sec, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione. </li></ol></li><li> Impostare il formato di rilevamento di &#39;Green intercalando Dye&#39; nella scheda Run Definizione. </li><li> Impostare il controllo di pipettaggio di &#39;Master Control&#39; nella scheda Run Definizione. Questa funzione serve come controllo interno e rileva la presenza di qPCR master mix in ciascun pozzetto della piastra multipozzetto 1.536, che è utile identificare putativi falsi negativi. </li><li> Inserire la piastra di 1.536 pozzetti preparato in passi 2-4 nello strumento 1.536 qPCR ed eseguire il programma. </li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Perform ispezione visiva dei dati all&#39;interno del software qPCR. NOTA: Il software 1.536 permette la visualizzazione sia amplificazione e fondere curve, così come una mappa di calore che mostra la chiamata (positivo, negativo, non valida, N / A, figura 2), il valore del punto di attraversamento (scorrevole scala colori per positiva o grigio per negativo; Figura 3), o una fluorescenza endpoint (EPF) valore (scalare colore). </li><li> Esportare dati dal software 1.536 sotto forma di un file txt (tabella dei risultati) o un file .xml sia con i dati grezzi o dati calcolati per l&#39;elaborazione offline dallo strumento. NOTA: Il proprietario punto di attraversamento automatizzato (Cp) algoritmo chiamando integrato nel software 1.536 prende in considerazione la forma e la pendenza della curva di amplificazione durante la determinazione / chiamate valore negativo e Cp positive con fiducia alta, a volumi di reazione microlitro basso sub con relativamente basso valori di fluorescenza. </li><li> Se il DNA LightCycler Verde Maestro era usod per qPCR, verificare che tutti i pozzetti superato il &#39;controllo master&#39;. Un fail indica il bene non ha ricevuto qPCR master mix e il punto di dati mancanti dovrebbe essere considerata un potenziale falso negativo. Verificare che tutti i pozzetti superato il &#39;controllo master&#39;. Un fail indica il bene non ha ricevuto Mastermix DNA e considerare il punto di dati mancanti un potenziale falso negativo. </li></ol>

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	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, JAM e JDB hanno nulla da rivelare. RC e AL sono impiegati da Roche Life Science, Stati Uniti e ha lavorato sullo sviluppo della applicazione con LAM come parte di una prova di principio dell&#39;esperimento.

Incorporazione di tempo reale di rilevamento PCR nel test di genotipizzazione PCRTag è uno sviluppo importante per il progetto Sc2.0 in quanto consente un throughput significativamente più alto. Il flusso di lavoro precedente specificato di 2,5 microlitri reazioni in 384 piatti ben PCR, 1,5 ore di runtime cicli termici, elettroforesi gel, e annotazione manuale del gel. Il flusso di lavoro qui presentato, chiamata analisi qPCRTag, supera diversi grandi colli di bottiglia. In primo luogo, una corsa qPCRTag condensa 4 x 384 pozzetti in un singolo esperimento che può essere elaborato, dall&#39;inizio alla fine (targa impostare più il tempo di esecuzione), in circa un&#39;ora. E &#39;significativo notare che il costo dei reagenti per pozzetto per l&#39;analisi qPCRTag è alla pari con l&#39;approccio basato gel agarosio rendimento inferiore. Tuttavia, eludendo elettroforesi su gel e annotazione manuale, il flusso di lavoro qPCRTag permette notevoli risparmi di tempo e manodopera, che sono i principali vantaggi. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qPCRTag è enramente compatibile con l&#39;automazione. Una preoccupazione principale con l&#39;uso della rilevazione in tempo reale come uscita del test PCRTag è il tasso di falsi positivi e falsi negativi. Poiché i primers PCRTag non sono stati originariamente progettati per l&#39;utilizzo in tempo reale PCR, si prevede che non tutte le coppie di primer sarà appropriato per l&#39;uso con questa uscita. A tal fine è importante per convalidare la funzione e la specificità di tutte le coppie di primer PCRTag escludere il sottoinsieme che non funzionano nel reale test basato sul tempo davanti. Per esempio, cromosoma 3 PCRTag falsi positivi e negativi sono by-e-grandi riproducibile in tempo reale di dati PCR (figure 2 e 3), e questi possono essere esclusi da ulteriori analisi. Inoltre, coppie di primer noti per fallire (valutato mediante elettroforesi su gel e riportati nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1) può anche essere esclusa. Questo è facilmente realizzabile semplicemente excluding le coppie di primer difettosi durante la configurazione del protocollo di trasferimento acustico. Come la maggior parte saggi ad alto rendimento, abbiamo intenzione di utilizzare il rilevamento PCRTag tempo reale come schermo primario per identificare trasformanti che meritano ulteriore convalida valle. Successivamente, il gold standard per lo screening secondario rimarrà analisi PCRTag con elettroforesi su gel come la lettura. Al di là l&#39;applicazione dell&#39;analisi PCRTag per Sc2.0, combinando sistemi di manipolazione su scala nanometrica liquido state-of-the-art, con un throughput elevato tempo reale tecnologia PCR consente analisi rapide e automatizzato e ha il potenziale per influenzare molti campi. Ad esempio, questo flusso di lavoro potrebbe essere applicata ad alto throughput screening biblioteca, la diagnosi delle malattie infettive, l&#39;analisi microbioma e all&#39;avanguardia di editing genoma approcci di tentare di modificare simultaneamente loci multipli.

Sc2.0, o il Progetto Genoma lievito sintetico ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), ha fissato l&#39;obiettivo di progettare e costruire un genoma eucariote completamente sintetico. Utilizzando la sequenza del genoma estremamente curata di Saccharomyces cerevisiae 3 come punto di partenza, ciascuno dei cromosomi lineari sedici è stato ri-progettato per soddisfare una serie di principi di progettazione che specificano mantenersi in forma delle cellule, migliorando la stabilità del genoma, e aumentando la flessibilità genetica. Ad esempio, gli elementi destabilizzanti come ripetizioni vengono cancellati dal cromosomi Sc2.0. Tutte le istanze di codoni di stop TAG sono ri-codificati per TAA a &#39;liberare&#39; un codone nel ceppo finale per l&#39;introduzione di un amminoacido non geneticamente codificato. Inoltre un sistema di evoluzione inducibile, Scramble, consentito dal sistema Cre-lox, permette la capacità senza precedenti di generare genomi derivati ​​con nuove strutture 4. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Un altro importante elemento di design nel genoma Sc2.0 è l&#39;introduzione di PCRTags, che servono come filigrane DNA per attivare il rilevamento di sintetico e selvaggio tipo DNA. PCRTags sono brevi segmenti ri-codificati in ORF sui cromosomi sintetici; mentre le sequenze PCRTag differiscono a livello di DNA tra i cromosomi tipo sintetico e selvatici, le proteine ​​codificate sono identici in sequenza aminoacidica e, quindi, presumibilmente, funzione. Sequenze PCRTag sono specificamente progettati come Primer siti di legame per facilitare l&#39;amplificazione selettiva (Figura 1A). Disegno PCRTag viene effettuata utilizzando l&#39;algoritmo &#39;più diversa&#39; in GeneDesign 5,6, cedevole ricodificati sequenze sintetiche che sono tipicamente ~ 60% diversa dalle sequenze native (minimo 33%) con temperature di fusione tra 58 ° C e 60 ° C e amplicon lunghezze tra 200-500 coppie di basi 2. Ricodifica non è consentito ai primi 100 bp di ciascuna ORF, come queste regioni sono noti perhanno preferenze particolari in termini di utilizzo codone 7. Insieme, queste regole di progettazione favoriscono alte prestazioni di quasi tutti i PCRTags sotto un unico insieme di condizioni di PCR quale tipo PCRTag coppie di primer di sintesi e selvaggi legano esclusivamente e amplificano DNA sintetico e nativo, rispettivamente (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figura 1:. PCRTag schema (A) PCRTags sono sequenze all&#39;interno di lettura aperta (ORF) dei geni sui cromosomi Sc2.0 ri-codificati. (B) sintetico (SYN) e wild type (WT) primer PCRTag legano esclusivamente e amplificano tipo sintetico e selvaggio DNA genomico (gDNA), rispettivamente. Qui è l&#39;analisi di un segmento ~ 30 kb del braccio sinistro del cromosoma sei, prova tredici PCRTag coppie di primer utilizzando sia WT o semi-synVIL2 gDNA come modello. In molti casi un singolo ORF codifica più PCRTag. Presenza / assenza di ampliconi PCRTag viene valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Ampliconi PCRTag variano nel formato da 200 bp a 500 bp. Le specie più veloce migrano nella parte inferiore dei pannelli sono dimeri di primer. Analisi PCRTag ha dimostrato di essere uno strumento importante per l&#39;assemblaggio di cromosomi Sc2.0. In un tipico esperimento 30-50 kb di DNA sintetico, che codifica 20-30 PCRTags, si trasforma in cellule di lievito per sostituire il corrispondente tipo selvaggio 1,2,8 DNA. Analisi PCRTag viene poi utilizzato per identificare trasformanti che codificano PCRTags sintetici ma non selvaggio di tipo abbracciano quel segmento di DNA, o cosiddetti &quot;vincenti&quot;. Di solito è necessario testare più trasformanti per identificare &quot;vincitori&quot;, così la produttività e costi di analisi PCRTag sono considerazioni importanti. Attualmente due cromosomi Sc2.0 sono stati completati (synIII 1 e synIXR 2), che rappresentano meno del 10% del genoma Sc2.0, although più della metà dei rimanenti cromosomi sono attualmente in fase di sintesi e l&#39;assemblaggio. La scala di analisi PCRTag necessaria per questo progetto sta rapidamente superando la possibilità di eseguire i gel e manualmente segnare la presenza di DNA sintetico e l&#39;assenza di selvaggio tipo DNA. Per migliorare il throughput del test PCRTag abbiamo sviluppato un flusso di lavoro mediante PCR in tempo reale per aggirare l&#39;uso di gel di agarosio. Il flusso di lavoro si avvale di un distributore di rinfuse liquide distribuire qPCR mastermix in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536, un distributore di liquido acustico nanoscala per trasferire DNA stampo e primer, e un termociclatore 1.536 qPCR, che ci permette di miniaturizzare le reazioni di 500 nl e massimizzare il throughput. Inoltre l&#39;analisi può essere automatizzata. Questo tipo di protocollo di genotipizzazione high throughput dovrebbe essere generalizzabili a qualsiasi progetto che richiede analisi di molti cloni di loci multipli.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Yeast gDNA prep</td></tr><tr><td>yeast gDNA</td><td>custom</td><td>custom</td><td>template for real time PCR</td></tr><tr><td>Acid-washed glass beads (0.5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>5432 Mixer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA quantification</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP plate</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA source plate</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep and dispensing</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>real time PCR mastermix</td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tube Holder</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra liquid handling system</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>cenrifugation of 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4">Template and primer dispensing</td></tr><tr><td>PCRTag primers</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>premixed forward and reverse, 50 &amp;mu;M each</td></tr><tr><td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>temporary seal for PCRTag primer plates</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 well plate</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>pre-mixed primer source plate</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate</td></tr><tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td></tr><tr><td>Clear Permanent Seal</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>can substitute ~2 mm thick washers</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td></tr><tr><td>Industrial Air Compressor</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>to run the Echo and Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>requires 220 V outlet</td></tr></tbody></table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Il Progetto Genoma lievito sintetico (Sc2.0) mira a costruire 16 cromosomi del lievito di design e riunire in un&#39;unica cellula di lievito. Ad oggi un cromosoma sintetico, synIII 1, e un braccio cromosoma sintetico, synIXR 2, sono stati costruiti e la loro funzione in vivo convalidato in assenza della corrispondente specie selvatiche cromosomi. Una caratteristica importante disegno di cromosomi Sc2.0 è l&#39;introduzione di PCRTags, che sono brevi sequenze ri-codificato all&#39;interno di lettura aperta (ORF) che consentono la differenziazione dei cromosomi sintetici dai loro omologhi di tipo selvatico. PCRTag primers ricottura selettivamente per entrambi i cromosomi di tipo sintetiche o selvatici e la presenza / assenza di ogni tipo di DNA può essere verificato utilizzando un semplice test PCR. La lettura standard del dosaggio PCRTag è valutare la presenza / assenza di ampliconi mediante elettroforesi su gel di agarosio. Tuttavia, con una densità media PCRTag amplicone di uno per 1.5 kb e agenome dimensione del ~ 12 Mb, il genoma Sc2.0 completato codificherà circa 8.000 PCRTags. Per migliorare il throughput, abbiamo sviluppato un saggio di rilevamento basato su PCR in tempo reale per PCRTag genotipizzazione che chiamiamo analisi qPCRTag. Il flusso di lavoro specifica di 500 reazioni nl in un piatto multipozzetto 1.536, che ci permette di testare fino a 768 PCRTags con entrambe le coppie di primer tipo sintetico e selvatici in un singolo esperimento.

Abbiamo testato sintetico e selvaggio tipo cromosoma 3 PCRTag coppie di primer 1 con il lievito DNA genomico (gDNA) estratto da quattro diversi ceppi. Cromosoma 3 ha 186 PCRTag coppie di primer che si estendono la lunghezza del cromosoma (synIII è ~ 270 kb e selvaggio tipo cromosomiche 3 è ~ 315 kb). Per testare ciascuno dei quattro ceppi con entrambe le serie di primer, abbiamo diviso la piastra multipozzetto in quattro quadranti, uno per ogni tipo di gDNA, assegnando primers sintetici PCRTag alla metà superiore di ogni quadrante e tipo selvaggio per la metà inferiore. Il DNA genomico è stato estratto dai ceppi di lievito, due dei quali codificano wild type cromosoma 3 (wild type, synIXR 2), mentre i restanti due codifica cromosoma sintetico 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR master mix è stato erogato in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536 con un dosatore di massa, seguito da gDNA e PCRTag primer utilizzando le Echo 550. primer sono stati schierati in modo identicoogni quadrante della piastra di pozzetti per un facile confronto visivo. La piastra pozzetti è stato poi termosaldato con guarnizione otticamente chiaro e sottoposto ad real time PCR. In questo esperimento qPCRTag abbiamo osservato, per la maggior parte, di amplificazione come previsto, per cui primers sintetici esclusivamente amplificate DNA sintetico e viceversa (figure 2 e 3). Tuttavia, abbiamo anche osservato diverse deviazioni dal modello previsto, suggerendo falsi negativi e falsi positivi nel dataset. In questo esperimento, la centralina è stata rilevata nel 100% dei pozzi, indicando il dosatore bulk erogato successo mastermix in ogni pozzetto della piastra (dati non mostrati). Questo esclude un potenziale fonte di falsi negativi. Inoltre, alcuni dei cromosomi 3 PCRTags sono noti a fallire (indicato nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1), di cui almeno 2 SYN e 1 WTcoppie di primer; quindi questi pozzi possono essere ignorati in ogni quadrante. Veri falsi negativi potrebbero derivare da una mancanza di trasferimento di template gDNA o primer, però nella nostra esperienza, data la corretta taratura della Echo 550, così come la preparazione di gDNA e primer come descritto, questo non è stato un importante fonte di errore. Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi negativi è stato estremamente basso per primer WT con modello WT (~ 2%), anche se leggermente superiore per i primer SYN con SYN DNA (~ 8%). I falsi positivi, il rilevamento di segnali in pozzi dove primers SYN sono mescolati con WT gDNA (e viceversa), possono derivare da amplificazione croce o dimeri di primer. Infatti, dimeri di primer sono spesso visibili mediante elettroforesi su gel (Figura 1B) e rappresentano una fonte di errore ragionevole. Per l&#39;applicazione della qPCR, l&#39;esame delle curve di fusione può essere utile per determinare se diverse specie, come dimeri di primer, possono contribuire a un segnale. Inoltre, performing un esperimento di controllo per cui primer sono dispensati in assenza del DNA stampo può aiutare a identificare primer con una propensione a dimerize. Amplificazione trasversale può essere osservata mediante elettroforesi su gel, in particolare se troppi cicli di PCR vengono eseguite o se la temperatura di ricottura è troppo bassa. Si è cercato di ridurre il numero di falsi positivi dovuta all&#39;amplificazione croce ottimizzando entrambi questi parametri per il protocollo qPCRTag. Infine, esaminando i valori valico (Cp) per ciascun bene può aiutare a identificare primer che non sono adatti al rilevamento basato su tempo reale (figura 3, per esempio, BB22, FB22, BB46, Fb46). Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi positivi è stato basso per primer SYN con modello WT (~ 5%) e superiore per primer WT con template SYN (~ 10%). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figura 2: Piastra mappa di calore visualizzazione presenza / abinvito indicationi per un esperimento qPCRTag. Quattro diversi tipi di DNA genomico (quadranti separati da linee bianche solide) sono stati sottoposti ad analisi PCRTag usando sintetica (SYN) e wild type (WT) cromosoma 3 primer PCRTag (tratteggiate linee bianche per separare SYN (top ) e WT (inferiore) in ogni quadrante). WT e synIXR gDNA codificano selvaggio tipo cromosoma 3, cedendo l&#39;amplificazione con primer WT PCRTag. SynIII e synIII synIXR gDNA codificano cromosoma sintetico 3, cedendo l&#39;amplificazione con primer SYN PCRTag. Primer sono disposte in base al loro posizionamento cromosomica da sinistra a destra e posizionate in modo identico nei quattro quadranti per il confronto. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figura 3: di calore a piastremappa mostrando valico (Cp) valore per un esperimento qPCRTag. Questo è lo stesso insieme di dati, come in figura 2 e il layout di piastra è quindi identica. N / A si riferisce a &#39;nessuna amplificazione&#39;. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.0K Views.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Ricerca

Bioingegneria

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Genetica

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the traditional method of choice is 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE). Protocols for 3&#39; RACE require the careful design and selection of nested primers within the 3&#39; untranslated region (3&#39; UTR) of the target gene of interest. However, with a few modifications the protocol can be used to include the entire 3&#39; UTR and sequences within the open reading frame (ORF), providing a more comprehensive picture of the relationship between the ORF and the 3&#39; UTR. This is in addition to identification of the polyadenylation signal (PAS), as well as the cleavage and polyadenylation site provided by conventional 3&#39; RACE. Expanded 3&#39; RACE can detect unusual 3&#39; UTRs, including gene fusions within the 3&#39; UTR, and the sequence information can be used to predict potential miRNA binding sites as well as AU rich destabilizing elements that may affect the stability of the transcript.

The two different 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE) protocols described here make use of two different DNA polymerases to map sequences that include a segment of the open reading frame (ORF), the stop codon, and the entire 3&#39; UTR of a transcript using RNA obtained from different cancer cell lines.

Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Ricerca sul cancro

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicina

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Immunologia e infezioni

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Biologia

Chip-Based Digital PCR to Detect Rare Transcript Variants Using a Nanofluidic Chip

Source: Molinari, C., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57066">Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates chip-based digital PCR &#8212; a variation of the digital PCR technique that is useful in detecting rare transcript variants. The PCR reaction is partitioned into the chambers of a nanofluidic chip, each of which acts as an independent reaction. The detection of fluorescence signals from the chambers with amplified targets confirms the presence of rare transcript variants in the sample.

PCR digitale basata su chip per rilevare rare varianti di trascritto utilizzando un chip nanofluidico

Source: Molinari, C., et al. Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR. J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

PCR Techniques

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Source: Kahyo, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58199">Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

PCR digitale basata su chip-in-a-tube per la quantificazione di varianti a singolo nucleotide

Source: Kahyo, T., et al. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the ...