1. الفحص العلمي الحرارية qPCR سولاريس تصميم الخوارزميات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخوارزمية المستخدمة في تصميم المسبار أزواج سولاريس / التمهيدي qPCR يضبط تيم كل مكون وبالتالي تمكين الدراجات ظروف عالمية. إدماج MGB ، أو ثانوية ملزمة الأخدود ، شاردة في التحقيق يزيد من تيم ويسمح للأقصر تحقيقات لتكون مصممة لمرونة أكبر وأداء الفحص. كما يوحي الاسم ، MGBs هي فئة من المضادات الحيوية التي يمكن أن تندرج في أخدود صغير من الحمض النووي الحلزون. وترد MGBs إلى نهاية 3 أو 5 من مسبار الحمض النووي. في الحل ، وتطفئ مضان مراسل FAM لجنة التحقيق التي فاكهه تقضي الكسوف المظلمة. عند التحقيق يربط تسلسل الهدف ، مما أدى إلى تغيير التشكل 3 - D التحقيق ق يسمح إشارة قوية الفلورسنت. واستقرت الملزمة لتحقيق الهدف تسلسل الحمض النووي لمن MGB ، والذي يسمح باستخدام المجسات ومحددة للغاية أقصر مع الحفاظ على درجة حرارة مناسبة للذوبان PCR. وهكذا ، كشف إشارة يحدث خلال مرحلة الصلب من التضخيم الهدف. خلال خطوة التمديد ، التحقيق MGB ينأى وتطفئ مرة أخرى مضان. لأن ينأى التحقيق ، فإنه لا يؤثر على كفاءة PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميزة أخرى من الخوارزمية سولاريس هو استخدام Superbases. يتم تعديل Superbases القواعد التي عززت قدرات ملزمة لتحسين الاستقرار والقضاء على السندات AT GG الذاتي الجمعيات في متواليات الغنية جوانين. وعلاوة على ذلك ، فإنها لا يشفي fluorophores المتاخمة المرفقة في نهاية 5. يتم وضع هذه القواعد بشكل انتقائي ، وفقا لخوارزمية ، لتوسيع نطاق توافر سلاسل الهدف. وهذا يجعل من الممكن استخدام متواليات ، مثل المناطق GC الغنية ، التي لولاها يمكن تجنبها في تصميم أجهزة الاشعال وتحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما كان ذلك ممكنا ، الخوارزمية سولاريس يضم مناطق تقاطع اكسون الممتدة في الموقع المستهدف. هذا يزيد من خصوصية من خلال تجنب التضخيم من الحمض النووي الجينومي الملوثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأهم من ذلك ، الخوارزمية يحدد أيضا سلسلة الآراء لجميع المتغيرات لصق المعروفة ، بحيث يتم تغطية كل واحدة من قبل المسبار / مجموعة التمهيدي. لذا ، لا بد من فحص واحد فقط لجينة معينة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا ، فإن الفحص qPCR سولاريس تصميم خوارزمية تستخدم المعلمات صارمة للغاية لاعتبارات التصميم الحرجة بما في ذلك المحتوى GC ، وطولها ، TM ، وتمتد من النيوكليوتيدات متجانسة. تسلسل الناتجة BLAST تحليلها لخصوصية استخدام 3 قواعد بيانات مختلفة : الجينومية ، نص ، وجين كاذب. </li></ol> 2. الحصول على الكواشف سولاريس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على سولاريس الكواشف المناسبة ، يمكنك زيارة <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / سولاريس</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الموقع انقر على &quot;البحث عن منتج GENEius&quot;. للذهاب مباشرة إلى البحث GENEius المنتج ، انتقل إلى <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر في مربع البحث والتحري في اختيار الكائن المستهدف المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن للبحث العديد من المنتجات GENEius عملية معرفات الجينات المختلفة. هنا ، تدخل أحد مصطلحات البحث للعثور على واقترح الجينات في المصالح ، بما في ذلك المرجع تسلسل الانضمام ، معرف الجينات ، والرمز الجيني ، ووصف جين ، معرف أو رقم سانجر الانضمام ، أو رقم الكتالوج. ثم انقر على &quot;بحث&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الجينات في المصالح والضغط على &quot;اختيار&quot; على الجانب الأيسر. وهذا فتح إطار يعرض مختلف المنتجات الحرارية العلمية المتاحة لهذا الجين من الفائدة. تحت عنوان &quot;المنتجات&quot; حدد &quot;الكشف qPCR&quot; الجدولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;سولاريس الفحص التعبير الجيني&quot; العنوان ، سترى أخرى مصممة بشكل أمثل سولاريس المسبار / الفحص التمهيدي. وهذا الاختبار غطاء واحد من كل المتغيرات لصق الجين المعروف الهدف الخاص بك. اختر الكمية المطلوبة. فهي متوفرة في 100 ، 400 ، 200 ، و 1000 X 25 التفاعلات ميكرولتر (إذا حددت مقايسة والتي هي من صنع النظام إلى أن حجم حزمة 100 لن تكون متاحة). بالنقر على &quot;أضف إلى السلة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، حدد المزيج المناسب للسيد cycler الحرارية التي سيتم استخدامها. لتحديد أي مزيج رئيسية ستعمل بشكل أفضل مع الجهاز المتاحة ، انقر على &quot;البحث عن سيد ميكس الذي يعمل بشكل أفضل مع Cycler PCR بك!&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على cycler qPCR التي سيتم استخدامها في القائمة لتحديد أي مزيج للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى البحث GENEius إطار المنتج ، واختيار المزيج المناسب الرئيسية. مزيج الرئيسي يأتي في 100 ، 400 ، 200 ، والأحجام رد فعل 1000. انقر على زر &quot;إضافة إلى السلة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا الإشارة الجينات اقترح ومستلزمات الصفحة اليسرى التوليف [كدنا] أن يؤمر لتحليل qRT - PCR كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل qPCR الكواشف سولاريس ، وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. وينبغي أن تلقى الكواشف التالية : حل 20X تحتوي على اثنين الاشعال المقدمة في 800 نانومتر لكل منهما وتحقيق تقدم في جين معين 200 نانومتر ، sequمعلومات عن التحقيق سينعقد على حد سواء ، وأجهزة الاشعال ، وسولاريس التعبير الجيني qPCR ميكس ماجستير في تركيز 2X. سولاريس التعبير الجيني فحوصات qPCR مستقرة لمدة لا تقل عن 12 شهرا. تجنب تكرار تجميد الذوبان. </li></ol> 3. qPCR الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ مع بروتوكول qPCR [كدنا]. وينبغي استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام أسلوب عمود الدوران. وأوصت اللجنة العلمية الحرارية عدة فيرسو [كدنا] تجميع لعكس النسخ لتوليد [كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير للذوبان والتي qPCR الشعائل وتحقيقات ، ومزيج الرئيسي على الجليد. كما تكون في متناولهم PCR المياه الصف ومبهمة لوحات qPCR البيضاء ، التي يمكن أن تحسن من حساسية في الوقت الحقيقي PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج يحتوي على جميع المكونات الرئيسية لPCR الوقت الحقيقي بما في ذلك : 1) بوليميريز الحمض النووي الحرارية ابدأ ، وإصدار الساخنة بداية بوليميريز الحمض النووي Thermoprime. ويستخدم هذا النوع من البلمرة لمنع غير محددة خلال تضخيم رد الفعل إعداد ويتطلب تفعيل الخطوة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 2) dNTPs في مزيج ماجستير سولاريس ، dTTP يستبدل dUTP لتعظيم الكفاءة التضخيم 3) رد فعل الملكية العازلة ، الأمثل للعمل مع المقايسات التمهيدي / سولاريس التحقيق. هذا رد فعل المخزن يحتوي على صبغة زرقاء لزيادة التباين بين الكاشف والبلاستيك. 4) ROX ، إذا كان الصك الخاص qPCR يتطلب ROX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تحسنت الحلول ، من خلال مزيج عبها الأنبوب (لا الدوامة). تدور عليهم لمنع فقدان كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وإعداد 15 مل أنبوب فالكون العقيمة لإعداد مزيج رد فعل لهذا الجين من الفائدة ، زائد واحد لهذا الجين المرجعية ، وزيادة اعتمادا على عدد من العينات. اعداد كافية من هذا القبيل يمكن ان ثلاثة مكررات تكون مستعدة لكل عينة ، بما في ذلك السيطرة قالب رقم (NTC) ، وعينات من منحنى القياسية ، إذا كان سيتم استخدام الأسلوب منحنى القياسية للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشغيل كل عينة على طبق من ذهب 96 كذلك ، مزيج ما يلي : 5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 0.5 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة يضاف [كدنا] سيكون 25 ميكرولتر. لكل عينة تعمل على 384 لوحة مزيج جيد ما يلي : 12.5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 1.25 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة [كدنا] وسوف يتم إضافة يكون 10 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor متعددة القنوات ، ونقل المزيج الرئيسي إلى الآبار المناسب للوحة. والصبغة الزرقاء المدرجة في مزيج رئيسية تساعد في تتبع التقدم pipetting على لوحات بيضاء. ثم ، تضاف 1-5 قالب ميكرولتر [كدنا] (لوحة 96 أيضا) أو 1-2 ميكرولتر من قالب [كدنا] (لوحة 384 أيضا). ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. وضع لوحة في جهاز للطرد المركزي وتدور باستمرار لإزالة أي فقاعات ، وهذه سوف تتداخل مع قراءات مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج cycler الحرارية : يجب تنشيط الانزيم مع 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (1 دورة). ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية ، وتمسخ لمدة 15 ثانية ، والصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الصك qPCR. بدء تشغيل البرنامج. </li></ol> ممثل النتائج qPCR باستخدام سولاريس <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. فحوصات الكشف عن إعطاء سولاريس موثوقة حتى بتركيزات منخفضة جدا المدخلات ، والحكم على كفاءة والقيم PCR R2. تم تضخيمها عشرة أضعاف التخفيفات 10 من [كدنا] تسلسل الاصطناعية توليفها من amplicon RNA أو تسلسل الحمض النووي amplicon على صك 7900HT ABI باستخدام سولاريس التعبير الجيني للF2RL1 qPCR الفحص أو CDC20 ، على التوالي. تظهر منحنيات التضخيم سجل النطاق والمنحنيات القياسية مع أداء كل مقايسة بما في ذلك الكفاءة والقيمة R2 ، دينامية مجموعة من التخفيفات LOG10 10 ، والحد الأدنى من الكشف. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. فحوصات سولاريس تعطي نتائج متسقة حتى بين مختلف الباحثين والمختبرات. وtransfected siRNAs استهداف ALDOA وPPIB ، فضلا عن عدم استهداف التحكم (NTC) ، إلى خلايا هيلا في 100 نانومتر و 10 و 1 و 0.1 تركيزات النهائي. وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مجموع عزل 48 ساعة بعد تلقي العلاج. تم تصنيعه باستخدام [كدنا] الحرارية العلمية كيت فيرسو التجميعي [كدنا]. تم تضخيمها وقسامة من [كدنا] في مختبرين منفصلين جغرافيا باستخدام سولاريس التعبير الجيني qPCR فحوصات للكشف عن ALDOA ، PPIB وGAPDH على LightCycler روش 480 (384 أيضا) منصة. تم احتساب ضربة قاضية باستخدام الأسلوب ΔΔCq (لتطبيع GAPDH إشارة الجينات والخلايا المعالجة NTC). وقد برهنت على نفس مستويات ضربة قاضية للأهداف الجينات سواء بين كل من الباحثين في كلا الموقعين.

كتاب هذه المقالة هي من موظفي العلمية الحرارية.

الحرارية العلمية سولاريس qPCR توفير فحوصات بسيطة ، وطريقة محسنة لأداء تحليل qPCR. باستخدام خوارزمية عالية الصرامة ، وإدماج التكنولوجيا وSuperbases MGB ، هذه المجموعات التمهيدي وتحقيق أقصى قدر من الدقة ومتانة التجارب qPCR. واحد وتعيين التحقيق التمهيدي تعترف جميع الصيغ المعروفة للصق الجين المعطى. الموقع المستهدف ، كلما كان ذلك ممكنا ، وتشمل المناطق الممتدة اكسون ، لضمان عدم تضخيم أن الحمض النووي الجيني. هذه الميزات تجعل من الممكن لتشغيل عينات عديدة في وقت واحد ، مما يقلل كثيرا من مقدار الوقت اللازم لإجراء التجارب المعقدة. منذ الرئيسي هو مزيج الأزرق ، فمن الممكن استخدام لوحات غير شفافة بيضاء ، والتي تحسن من الحساسية للqPCR ، دون أن تفقد مسار pipetting. اتخذت جميع معا ، ملامح تصميم الفحص qPCR سولاريس جعل هذا الاختبار qPCR رواية مقايسة بسيطة ، ولكنها عالية الأداء في آن معا محددة وقوية.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

الجينات qPCR سولاريس الفحص التعبير هو نوع من الرواية التمهيدي / المسبار مجموعة ، وتهدف إلى تبسيط عملية qPCR مع الحفاظ على حساسية ودقة الفحص. وهذه المجموعات التمهيدي / المسبار مصمم مسبقا على 98 ٪&gt; من الجينوم البشري والفأر والتحسينات ميزة كبيرة من التكنولوجيات المتاحة سابقا. وقد جاءت هذه التحسينات الممكنة بحكم رواية خوارزمية التصميم الذي وضعه خبراء المعلوماتية الحيوية الحرارية العلمية. وأدرجت العديد من المزايا المريحة في الفحص qPCR سولاريس لتبسيط عملية تنفيذ الكمية في الوقت الحقيقي PCR. أولا ، بروتوكول مماثل إلى البدائل استخداما ، لذلك فإن الأساليب المستخدمة خلال qPCR من المحتمل أن تكون مألوفة. الثاني ، هو مزيج الرئيسي الأزرق ، الأمر الذي يجعل تحديد ردود الفعل qPCR أسهل لتعقب. الثالثة ، والظروف الدراجات الحرارية هي نفسها بالنسبة للجميع المقايسات (الجينات) ، مما يجعل من الممكن لتشغيل كثير من العينات في وقت واحد والحد من احتمالات الخطأ. أخيرا ، تقدم لجنة التحقيق التمهيدي وتسلسل المعلومات ، وتبسيط عملية النشر. هنا ، ونحن لشرح كيفية الحصول على الكواشف المناسبة سولاريس البحث باستخدام ميزة المنتج GENEius العثور على موقع على شبكة الإنترنت بسهولة (www.thermo.com / سولاريس) وكيفية استخدام الكواشف سولاريس لأداء qPCR باستخدام أسلوب منحنى القياسية.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

فحوصات الجينات qPCR التعبير هي رواية سولاريس مصمم مسبقا qPCR التمهيدي / مسبار تركيبات المصممة لتبسيط عملية qPCR دون التضحية خصوصية ومتانة مقايسة.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K Views.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Cancer Research

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

الكشف الجزيئي في الموقع من فيتوباثوجينس المنقولة بالتربة باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Environment

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicine

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Immunology and Infection

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona 
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also known as real-time PCR, is a widely-used molecular technique for enumerating microorganisms in the environment. Prior to this approach, quantifying microorganisms was limited largely to classical culture-based techniques. However, the culturing of microbes from environmental samples can be particularly challenging, and it is generally held that as few as 1 to 10% of the microorganisms present within environmental samples are detectable using these techniques. The advent of qPCR in environmental microbiology research has therefore advanced the field greatly by allowing for more accurate determination of concentrations of microorganisms such as disease-causing pathogens in environmental samples. However, an important limitation of qPCR as an applied microbiological technique is that living, viable populations cannot be differentiated from inactive or non-living populations.
This video demonstrates the use of qPCR to detect pepper mild mottle virus from an environmental water sample.

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...