Approccio completo per l'isolamento microbico dai tunnel dell'idrosadenite suppurativa

Mostriamo un metodo per isolare con successo organismi meticolari e anaerobi dai tratti del seno cutaneo (tunnel) nei tessuti asportati da pazienti con idrosadenite suppurativa.

L'idrosadenite suppurativa (HS) è una condizione debilitante caratterizzata da noduli e ascessi dolorosi, che progredisce verso i tratti sinusali (tunnel) all'interno degli strati dermici della pelle, causando disagio significativo, secrezioni maleodoranti, deturpazioni, contratture e cicatrici, che riducono gravemente la qualità della vita. L'HS è associata ad alterazioni del microbioma cutaneo, influenzando la regolazione immunitaria e la difesa della pelle contro i batteri nocivi. Nonostante la sua prevalenza, il contributo del microbioma HS alla patologia della malattia e la limitata risposta al trattamento rimangono in gran parte sconosciuti. Ad oggi, diversi studi di sequenziamento dell'rRNA 16S sul tessuto HS hanno raggiunto solo la granularità a livello di genere, identificando un aumento degli anaerobi Gram-negativi e una diminuzione dei commensali cutanei. Una comprensione più profonda della disbiosi microbica negli individui con HS è essenziale per ottimizzare le strategie di trattamento. Ciò richiede un duplice approccio alla valutazione del microbioma HS, compreso l'isolamento delle specie batteriche, che sono spesso sottoutilizzate negli studi traslazionali incentrati sui disturbi della pelle. L'isolamento di singoli microrganismi dal tessuto HS è fondamentale per chiarire il ruolo dei batteri nella patogenesi dell'HS. Qui, evidenziamo i metodi riproducibili per isolare con successo i patogeni anaerobi dal tessuto del tunnel HS, fornendo il passo iniziale e più critico nella comprensione del ruolo batterico nell'HS. Questo metodo apre la strada a una ricerca mirata sui contributi microbici all'HS e allo sviluppo di strategie di trattamento più efficaci e personalizzate che affrontano il complesso carico microbico di questa condizione cronica.

L'idrosadenite suppurativa (HS) è una condizione dermatologica comune caratterizzata da noduli e ascessi che progrediscono verso i tratti sinusali (tunnel) formati all'interno degli strati dermici e sottocutanei della pelle, causando dolore significativo, producendo secrezioni purulente, deturpazione e sequele psicosociali debilitanti ^1,2. L'HS colpisce in modo sproporzionato le donne e gli individui con pelle di colore, che emerge tipicamente nella tarda adolescenza o nella prima età adulta². I gravi sintomi fisici della condizione sono aggravati dal suo profondo impatto psicosociale, tra cui depressione, ansia e isolamento sociale, che possono ridurre gravemente la qualità^{della vita.} I tunnel HS formati allo stadio avanzato della malattia riducono significativamente le probabilità di risposta dei pazienti alla terapia biologica attualmente approvata e l'escissione chirurgica rimane l'unico approccio terapeutico ^4,5.

Diversi studi hanno caratterizzato il microbioma associato ai tunnel HS, mostrando una prevalenza di patogeni anaerobi e una ridotta abbondanza di commensali cutanei ^6,7,8, con studi recenti che identificano Porphyromonas spp. (tipo I) e Prevotella spp. (IV) nei tunnel, tra gli altri generi⁹. Un altro studio ha rilevato variazioni nel microbioma HS in base alla profondità del campionamento tissutale, confermando l'unicità della composizione microbica nel tessuto tunnel¹⁰. Inoltre, è stato dimostrato che la disbiosi influenza la risposta immunitaria nell'HS, implicando ulteriormente il ruolo dei microbi nella patogenesi della malattia 11,12,13,14. Sebbene sia in uso un trattamento antibiotico sistemico prolungato con clindamicina, rifampicina e tetracicline e abbia mostrato una riduzione del numero di tunnel di drenaggio nei pazienti affetti^15,16, i dati sui patogeni anaerobi resistenti agli antibiotici nell'HS rimangono sconosciuti. Finora, non è stato riportato l'isolamento di ceppi batterici dai tunnel HS, limitando gli studi su nuovi trattamenti antimicrobici e la valutazione approfondita del contributo dei patogeni alla patogenesi della malattia. La standardizzazione dei metodi per l'isolamento dei patogeni non solo faciliterebbe una vera comprensione del ruolo batterico nella patogenesi dell'HS, ma consentirebbe anche la traduzione verso interventi più mirati e migliorati.

Qui, evidenziamo un metodo per isolare con successo i microrganismi dal tessuto del tunnel HS. L'isolamento delle singole specie batteriche è un passo iniziale cruciale per comprendere il loro ruolo nella patologia dell'HS. Questo metodo apre la strada a una ricerca mirata sui contributi microbici all'HS e allo sviluppo di strategie di trattamento più efficaci e personalizzate che affrontano i patogeni batterici in questa condizione cronica.

Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Università di Miami (protocollo #20200187). Il consenso informato viene ottenuto dai pazienti (n = 18, età media ± deviazione standard = 30,9 ± 9,4, 12 femmine, 6 maschi) con diagnosi di tunnel HS e/o dai loro tutori legali prima della procedura dopo una precedente discussione della ricerca per consentire di affrontare eventuali dubbi o domande.

1. Raccolta del campione del paziente

1. Prima di maneggiare il tessuto asportato, utilizzare rigorose precauzioni sterili per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. L'individuo che maneggia il tessuto deve indossare un camice da laboratorio, una maschera facciale e un cappuccio chirurgico e utilizzare guanti e strumenti sterili per maneggiare il tessuto.
2. Per il controllo della sterilità, immergere le pinze pre-autoclavate nella fiala di trasporto anaerobico prima di processare il tessuto (Tabella dei materiali).
3. Raccogliere il tessuto cutaneo, resecato chirurgicamente per mezzo di un bisturi o di un laser CO₂ , dalle aree interessate di pazienti con diagnosi di tunnel HS e posizionarlo immediatamente in una capsula di Petri sterile utilizzando una pinza sterile per un'ulteriore elaborazione.
4. Mentre si è presso il centro chirurgico o l'ambulatorio, identificare i tunnel all'interno del tessuto asportato sondando la pelle con una pinza pre-autoclavata, come mostrato nella Figura 1A.
5. Eseguire biopsie con punch da 6 mm attraverso la pelle a tutto spessore del tunnel identificato subito dopo l'escissione tissutale e immergerle nel terreno tamponato semisolido con agenti riducenti nel sistema anaerobico per il trasporto di fiale di vetro per ottimizzare la sopravvivenza delle specie batteriche anaerobiche per ulteriori analisi.
6. Trasportare il tessuto tunnel nelle fiale anaerobiche al laboratorio su ghiaccio.
7. Eseguire la documentazione di esempio come descritto di seguito.
   1. Il giorno della procedura, raccogli le informazioni sul paziente, inclusi dati demografici, età, etnia/razza auto-dichiarata e farmaci attuali, senza alcun identificatore personale. I siti corporei del tessuto resecato accompagnano un diagramma corporeo, poiché i tunnel HS possono verificarsi in più siti corporei. Scattare fotografie del tessuto asportato da entrambi i lati del campione prima e dopo l'elaborazione dei tessuti, documentando la posizione della biopsia generata da un tunnel. All'arrivo in laboratorio, registrare i campioni di tessuto codificati senza alcun identificatore personale in un database elettronico e sicuro.

2. Lavorazione della pelle HS

1. Allestimento e placcatura
   1. Indossa un camice da laboratorio e guanti e lega i capelli per evitare contaminazioni. Piastre di agar sanguigno preriscaldate, tra cui agar sanguigno Brucella lakhed con agar Kanamicina e Vancomicina (LKV), agar tripticasi Soia (TSA II) 5% di sangue di pecora (SB), infuso cardiaco cerebrale (BHI) e agar alcool feniletilico (PEA) con agar SB al 5% a 37 °C in un incubatore per 10 minuti. Pulire la cabina di biosicurezza con etanolo al 70% prima della lavorazione dei tessuti.
   2. Una volta riscaldate le piastre di agar, etichettare la base o il lato della piastra con il nome del campione codificato e la data. Posizionare le pinze autoclavate, i bisturi, le anse di inoculazione pre-sterilizzate e le piastre di agar nella cabina di biosicurezza.
   3. Rimuovere la biopsia con punzone da 6 mm dalla fiala di trasporto anaerobico con pinza sterile immergendo la pinza nel terreno. Taglia rapidamente il tessuto in piccoli pezzi, di circa 1 mm² ciascuno, usando un bisturi sterile. Posizionare il tessuto in una provetta sterile da microcentrifuga contenente 500 μl di terreno clostridiale rinforzato (RCM) e agitare brevemente.
      NOTA: L'omogeneizzazione non è stata utilizzata perché i campioni sarebbero stati esposti all'ambiente aerobico per un periodo prolungato, il che avrebbe potuto portare a un'ulteriore aerazione durante il processo e alla potenziale perdita di batteri anaerobici.
   4. Utilizzando un nuovo ansa sterile, eseguire ripetute striature del quadrante della sospensione tissutale contenente organismi batterici sulle piastre di agar TSA II 5% SB, LKV, PEA con 5% SB e BHI.
   5. Utilizzando la restante sospensione di tessuto tritato, preparare scorte di glicerolo aggiungendo il 20% v/v di glicerolo sterile e l'80% v/v di sospensione tissutale in una crioprovetta. Conservare le scorte di glicerolo a 80 °C. Nel caso di una vitalità limitata dei batteri isolati, è possibile utilizzare stock di tessuto per ripetere l'isolamento.
   6. Introdurre tutte le piastre nell'incubatore a 37 °C in una camera anaerobica racchiusa con una confezione di CO₂ . Controllare le piastre ogni 2-3 giorni, aspettandosi la crescita degli anaerobi 7-14 giorni dopo la placcatura. Documenta le morfologie delle colonie fotografando le placche.
2. Banca dei tessuti
   1. Utilizzare una biopsia con punzone da 8 mm per raccogliere ulteriori campioni di pelle a tutto spessore attraverso il tunnel e lontano dal tunnel per il campione FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) e la valutazione istologica, poiché è più probabile che un campione di tessuto più grande catturi l'intero tunnel.
   2. Conservare ulteriori biopsie con punch da 6 mm per l'isolamento di DNA (snap frozen), RNA (in RNA successivo) e proteine (snap frozen).
3. Mantenimento della colonia
   1. Una volta osservate le colonie sulle tavole originali, fotografare le lastre e prendere nota della morfologia distinta della colonia¹⁷. In generale, prevedere 10-15 diverse morfologie di colonie (vedi Figura 1).
   2. Preparare LKV, BHI, PEA preriscaldati con piastre di agar 5% SB e TSA II 5% SB (Tabella dei materiali). Etichettare ogni etichetta della piastra con l'ID del campione, la posizione della biopsia e la data.
   3. Utilizzando un puntale per pipetta sterile, prelevare una singola colonia e striarla con un movimento a zig-zag sullo stesso tipo di piastra su cui è stata rilevata. Quindi, utilizzando lo stesso puntale della pipetta con la colonia come modello per un'amplificazione PCR con rDNA 16s, seguire i passaggi seguenti.
   4. Ripetere il passaggio 2.3.3 utilizzando le colonie selezionate da tutti i tipi di piastre di agar con un nuovo puntale di pipetta sterile e una colonia singolare diversa della morfologia distinta dalla piastra originale. Anche in questo caso, subito dopo la striatura, utilizzare la punta della pipetta con la colonia rimanente per immergerla in un pozzetto di piastra PCR dedicato, in quanto ciò fornirà un modello per l'amplificazione PCR.
   5. Ripetere i passaggi 2.3.3-2.3.4 per ogni colonia distinta fino a quando tutte le colonie con morfologia specifica in tutti e quattro i tipi di piastre di agar sono state striate e i corrispondenti pozzetti PCR sono stati inoculati contemporaneamente.
   6. Conservare le piastre di agar appena piastrate nell'incubatore a 37 °C in una camera anaerobica racchiusa con una confezione di CO₂ . Una volta che le colonie crescono, assicurarsi della purezza della colonia isolata prima di conservare le scorte batteriche (vedi sotto). Se le colonie piastrate mancano di uniformità, ripetere il passaggio 2.3.3. Eseguire il processo di riplaccatura ogni 4-5 giorni, a seconda della crescita della colonia, fino a quando le colonie non hanno un aspetto uniforme.
4. Identificazione di specie batteriche mediante sequenziamento di colonie di colonie di rDNA 16s
   1. Preparare una piastra PCR con una miscela master composta da 2,5 μL di 10 μM 16S rDNA V1-V3 forward (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') e primer reverse (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 μL di 2x Master Mix polimerasi e 10 μL di acqua microbica priva di DNA per pozzetto per un volume totale di 25 μL per colonia.
   2. Calcolare il volume di una master mix PCR necessaria per l'amplificazione da tutte le colonie selezionate, il controllo negativo (senza modello) e il controllo positivo - è possibile utilizzare qualsiasi ceppo di laboratorio; usiamo comunemente lo Staphylococcus aureus USA300.
   3. Portare una piastra PCR nella cabina di biosicurezza, coprendo i pozzetti per evitare la contaminazione. Utilizzare una singola colonia da un puntale di pipetta sterile per la piastra. Risospendere immediatamente la colonia con un rigoroso roteamento nel pozzetto designato con la miscela master preriempita. Utilizzare lo stesso puntale della pipetta sia per la subcoltura che per il campionamento per la PCR.
   4. Ripetere il passaggio 2.4.3 per tutte le singole colonie HS e il controllo positivo.
   5. Eseguire la PCR con il seguente protocollo: 95 °C per 5 minuti per la denaturazione iniziale necessaria per lisare la colonia selezionata, seguita da 40 cicli di 95 °C per 15 s, 54 °C per 1 minuto, l'uso del ciclo finale di 4 °C è facoltativo. Un termociclatore può essere utilizzato anche con le stesse impostazioni del programma.
   6. Eseguire l'elettroforesi su gel con prodotti qPCR amplificati per verificare la dimensione dell'amplicona, che dovrebbe essere di 311 bp (Figura 2). Purificare con successo il frammento di rDNA 16s amplificato con il kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
   7. Inviare il prodotto PCR purificato per il sequenziamento Sanger dell'RNA ribosomiale 16S utilizzando i primer 16S rDNA V1-V3 in avanti e all'indietro.
5. Stock batterici
   NOTA: Gli anaerobi esigenti sono noti per la loro limitata vitalità sulle piastre di agar.
   1. Al fine di garantire la conservazione del ceppo prima di ottenere i risultati del sequenziamento, che confermeranno l'identità della specie, generare piastre di agar da una singola colonia e confermare la purezza per generare gli stock. Generare stock direttamente dalla piastra di agar in parallelo con l'ottimizzazione delle condizioni di crescita nel mezzo liquido.
   2. Per preparare il brodo dalla piastra generata nella fase 2.3, utilizzare un anello di inoculazione sterile da 6 mm per prelevare il maggior numero possibile di colonie uniformi. Quindi, risospendere energicamente i batteri in 800 μL di RCM con il 20% di glicerolo sterile in crioprovette e conservarli a -80 °C per creare uno stock batterico.
      NOTA: Questa fase garantisce la conservazione tempestiva dei patogeni fastidiosi prima di ottenere la caratterizzazione mediante dati di sequenziamento.
   3. Eseguire l'ottimizzazione della crescita in coltura liquida e la generazione di ceppi da una singola colonia una volta confermata la classificazione del ceppo.

In questo studio, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di batteri anaerobi da tunnel HS. Questo protocollo è nuovo e notevole per la creazione del potenziale per testare la funzione e la virulenza di questi batteri utilizzando modelli di infezione cutanea in vitro, ex vivo e in vivo per aumentare la nostra comprensione del contributo microbico alla patogenesi dell'HS. In primo luogo, abbiamo identificato i tunnel dalla pelle reseca...

In questo studio, presentiamo un nuovo metodo per isolare e mantenere i batteri che colonizzano i tunnel HS. Questo metodo riproducibile non solo consentirà una caratterizzazione approfondita dei ceppi presenti in queste strutture patologiche, ma consentirà anche successivi studi funzionali che esploreranno il ruolo di specifici microbi nella patogenesi dell'HS. Le fasi critiche del protocollo includono la raccolta e il trasporto dei tessuti in mezzi anaerobici, che facilita la conserv...

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

Questo lavoro è stato sostenuto da R01AR083385 (IP, MTC, HLT), P50MD017347 (TG, IP, HLT) e dalla sovvenzione di ricerca HS Foundation Danby (TG). Questo lavoro è stato inoltre supportato dalla sovvenzione NIH 1S1OD023579-01 per la casa dello scanner per vetrini VS120 presso la Miller School of Medicine Analytical Imaging Core Facility dell'Università di Miami.