גישה מקיפה לבידוד מיקרוביאלי ממנהרות Hidradenitis Suppurativa

אנו מציגים שיטה לבידוד מוצלח של אורגניזמים קפדניים ואנאירוביים מדרכי הסינוס העוריות (מנהרות) ברקמות שנכרתו מחולים עם Hidradenitis Suppurativa.

Hidradenitis Suppurativa (HS) הוא מצב מתיש, המתאפיין בגושים ומורסות כואבות, המתקדם לדרכי הסינוסים (מנהרות) בתוך שכבות העור של העור, וגורם לאי נוחות משמעותית, הפרשות מסריחות, עיוותים, התכווצויות וצלקות, אשר פוגעים קשות באיכות החיים. HS קשור לשינויים במיקרוביום העור, המשפיעים על ויסות מערכת החיסון ועל הגנת העור מפני חיידקים מזיקים. למרות שכיחותו, תרומתו של מיקרוביום HS לפתולוגיה של המחלה והתגובה המוגבלת לטיפול נותרה ברובה לא ידועה. עד כה, מחקרי ריצוף 16S rRNA מרובים על רקמת HS השיגו רק גרעיניות ברמת הסוג, וזיהו עלייה באנאירובים גראם-שליליים וירידה בקומנסל העור. הבנה מעמיקה יותר של דיסביוזה מיקרוביאלית אצל אנשים עם HS חיונית לאופטימיזציה של אסטרטגיות הטיפול. זה דורש גישה דו-כיוונית להערכת המיקרוביום של HS, כולל בידוד של מיני חיידקים, שלעתים קרובות אינם מנוצלים מספיק במחקרים תרגומיים המתמקדים במחלות עור. בידוד מיקרואורגניזמים בודדים מרקמת HS הוא חיוני להבהרת תפקידם של חיידקים בפתוגנזה של HS. כאן, אנו מדגישים שיטות הניתנות לשחזור לבידוד מוצלח של פתוגנים אנאירוביים מרקמת מנהרת HS, ומספקים את הצעד הראשוני והקריטי ביותר בהבנת תפקיד החיידקים ב-HS. שיטה זו סוללת את הדרך למחקר ממוקד על תרומות מיקרוביאליות ל-HS ולפיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות ומותאמות אישית המתייחסות לנטל המיקרוביאלי המורכב של מצב כרוני זה.

Hidradenitis Suppurativa (HS) הוא מצב דרמטולוגי שכיח המאופיין בגושים ומורסות המתקדמים לדרכי הסינוסים (מנהרות) הנוצרות בתוך שכבות העור והתת עוריות של העור, וגורמים לכאב משמעותי, מייצרים הפרשות מוגלתיות, עיוותים והשלכות פסיכו-סוציאליות מתישות ^1,2. HS משפיע באופן לא פרופורציונלי על נשים ואנשים עם עור צבעוני, המופיע בדרך כלל בסוף גיל ההתבגרות או בבגרות המוקדמת². התסמינים הגופניים החמורים של המצב מורכבים על ידי ההשפעה הפסיכו-סוציאלית העמוקה שלו, כולל דיכאון, חרדה ובידוד חברתי, שעלולים לפגוע קשות באיכות החיים³. מנהרות HS שנוצרו בשלב המחלה המתקדם מפחיתות משמעותית את הסיכויים לתגובת החולים לטיפול ביולוגי המאושר כיום, וכריתה כירורגית נותרה גישת הטיפול היחידה ^4,5.

מחקרים רבים אפיינו את המיקרוביום הקשור למנהרות HS, והראו שכיחות של פתוגנים אנאירוביים ושפע מופחת של קומנסלים עוריים ^6,7,8, כאשר מחקרים אחרונים זיהו את Porphyromonas spp. (סוג I) ו-Prevotella spp. (IV) במנהרות, בין שאר הסוגים⁹. מחקר אחר מצא שונות במיקרוביום HS לפי עומק דגימת הרקמה, מה שאישר את הייחודיות של הרכב החיידקים ברקמת התעלה¹⁰. בנוסף, הוכח כי דיסביוזה משפיעה על התגובה החיסונית ב-HS, מה שמרמז עוד יותר על תפקידם של חיידקים בפתוגנזה של המחלה 11,12,13,14. למרות שטיפול אנטיביוטי מערכתי ממושך בקלינדמיצין, ריפמפיצין וטטרציקלינים נמצא בשימוש והראה ירידה במספר מנהרות הניקוז בחולים שנפגעו^15,16, הנתונים על פתוגנים אנאירוביים עמידים לאנטיביוטיקה ב-HS נותרו לא ידועים. עד כה, לא דווח על בידוד זני חיידקים ממנהרות HS, מה שמגביל את המחקרים על טיפולים אנטי-מיקרוביאליים חדשים והערכה מעמיקה של תרומת הפתוגנים לפתוגנזה של המחלה של HS. סטנדרטיזציה של שיטות לבידוד פתוגנים לא רק תאפשר תובנות אמיתיות לגבי תפקיד החיידקים בפתוגנזה של HS אלא גם תאפשר תרגום להתערבויות ממוקדות ומשופרות יותר.

כאן, אנו מדגישים שיטה לבודד בהצלחה מיקרואורגניזמים מרקמת מנהרת HS. בידוד מיני חיידקים בודדים הוא צעד מכריע וראשוני בהבנת תפקידם בפתולוגיה של HS. שיטה זו סוללת את הדרך למחקר ממוקד על תרומות מיקרוביאליות ל-HS ולפיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות ומותאמות אישית המטפלות בפתוגנים חיידקיים במצב כרוני זה.

פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) באוניברסיטת מיאמי (פרוטוקול #20200187). הסכמה מדעת מתקבלת ממטופלים (n = 18, גיל ממוצע ± סטיית תקן = 30.9 ± 9.4, 12 נשים, 6 גברים) שאובחנו עם מנהרות HS ו/או האפוטרופוסים החוקיים שלהם לפני ההליך לאחר דיון קודם במחקר כדי לאפשר התייחסות לכל חשש או שאלה.

1. איסוף דגימות מטופלים

1. לפני הטיפול ברקמה שנכרתה, השתמש באמצעי זהירות סטריליים קפדניים כדי למזער את הסיכון לזיהום. האדם המטפל ברקמה צריך ללבוש מעיל מעבדה, מסכת פנים וכובע כירורגי ולהשתמש בכפפות סטריליות ובמכשירים סטריליים כדי לטפל ברקמה.
2. לבקרת סטריליות, טבלו מלקחיים לפני חיטוי בבקבוקון ההובלה האנאירובית לפני עיבוד הרקמה (טבלת חומרים).
3. לאסוף רקמת עור, שנכרתה בניתוח באמצעות אזמל או לייזר CO₂ , מאזורים פגועים של חולים שאובחנו עם מנהרות HS ולהניח אותה מיד בצלחת פטרי סטרילית באמצעות מלקחיים סטריליים להמשך עיבוד.
4. כשאתה במרכז הכירורגיה או במרפאת החוץ, זהה מנהרות בתוך רקמה שנכרתה על ידי חיטוט העור עם מלקחיים לפני חיטוי, כפי שמוצג באיור 1A.
5. קח ביופסיות אגרוף של 6 מ"מ דרך העור בעובי המלא של המנהרה המזוהה מיד לאחר כריתת הרקמה וטבול במדיה המאגרת המוצקה למחצה עם חומרי הפחתה בבקבוקוני זכוכית להובלת המערכת האנאירובית כדי לייעל את ההישרדות של מיני חיידקים אנאירוביים להמשך ניתוח.
6. הובלת רקמת המנהרה בבקבוקונים האנאירוביים למעבדה על קרח.
7. בצע תיעוד לדוגמה כמתואר להלן.
   1. ביום ההליך, אסוף מידע על המטופל, כולל נתונים דמוגרפיים, גיל, מוצא אתני/גזע שדווח על עצמו ותרופות עדכניות, ללא כל זיהוי אישי. אתרי הגוף של רקמה שנכרתה מלווים תרשים גוף, שכן מנהרות HS יכולות להתרחש במספר אתרי גוף. צלם תמונות של רקמה שנכרתה משני צידי הדגימה לפני ואחרי עיבוד הרקמות, ותעד את מיקום הביופסיה שנוצרה ממנהרה. עם ההגעה למעבדה, רשום את דגימות הרקמה המקודדות ללא כל מזהים אישיים במסד נתונים אלקטרוני ומאובטח.

2. עיבוד עור HS

1. הגדרה וציפוי
   1. לבשו חלוק מעבדה וכפפות, וקשרו שיער כדי למנוע זיהום. צלחות אגר דם מחממות מראש, כולל אגר דם ברוצלה עם אגר קנמיצין וונקומיצין (LKV), אגר סויה טריפטיקז (TSA II) 5% אגר דם כבשים (SB), עירוי לב מוח (BHI) ואגר אלכוהול פנילאתיל (PEA) עם אגר SB 5% עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 10 דקות. נקה את ארון הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול לפני עיבוד הרקמה.
   2. לאחר חימום לוחות האגר, סמן את הבסיס או הצד של הצלחת עם שם המדגם המקודד והתאריך. הניחו מלקחיים חיטוי, אזמלים, לולאות חיסון מעוקרות מראש וצלחות אגר בארון הבטיחות הביולוגית.
   3. הסר את ביופסיית האגרוף בגודל 6 מ"מ מבקבוקון ההובלה האנאירובית בעזרת מלקחיים סטריליים על ידי טבילת המלקחיים במדיה. קוצצים במהירות רקמות לחתיכות קטנות, כ -1 מ"מ² כל אחת, בעזרת אזמל סטרילי. הנח רקמה בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי המכיל 500 מיקרוליטר של מדיום קלוסטרידיאלי מחוזק (RCM) ומערבולת קצרה.
      הערה: לא נעשה שימוש בהומוגניזציה מכיוון שהדגימות היו חשופות לסביבה האירובית לתקופה ממושכת, מה שעלול היה להוביל לאוורור נוסף במהלך התהליך ולאובדן פוטנציאלי של חיידקים אנאירוביים.
   4. באמצעות לולאה סטרילית חדשה, בצע פסים חוזרים ונשנים של תרחיף הרקמה המכיל אורגניזמים חיידקיים על לוחות TSA II 5% SB, LKV, PEA עם 5% SB ו-BHI agar.
   5. באמצעות תרחיף הרקמות הקצוץ שנותר, הכינו מלאי גליצרול על ידי הוספת 20% גליצרול סטרילי v/v ו-80% תרחיף רקמות v/v ב-cryotube. אחסן מלאי גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס. במקרה של כדאיות מוגבלת של חיידקים מבודדים, ניתן להשתמש במלאי רקמות כדי לחזור על הבידוד.
   6. מניחים את כל הצלחות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא אנאירובי הסגור בחבילת CO₂ . בדוק את הצלחות כל 2-3 ימים, בציפייה לצמיחה של אנאירובים 7-14 ימים לאחר הציפוי. תעד מורפולוגיות של מושבות על ידי צילום לוחות.
2. בנק רקמות
   1. השתמש בביופסיית אגרוף של 8 מ"מ כדי לאסוף דגימות עור נוספות בעובי מלא דרך המנהרה והרחק מהמנהרה לדגימת פורמלין קבוע פרפין משובץ (FFPE) והערכה היסטולוגית, מכיוון שדגימת רקמה גדולה יותר נוטה יותר ללכוד את המנהרה המלאה.
   2. שמור ביופסיות ניקוב נוספות של 6 מ"מ עבור DNA (קפוא בהצמד), RNA (ב-RNA מאוחר יותר) ובידוד חלבון (קפוא בהצמד).
3. תחזוקת המושבה
   1. לאחר שנצפו מושבות על הלוחות המקוריים, צלם לוחות ושים לב למורפולוגיה מובהקת של מושבה¹⁷. באופן כללי, צפו 10-15 מורפולוגיות שונות של מושבות (ראו איור 1).
   2. הכן לוחות אגר LKV, BHI, PEA מחוממים מראש עם צלחות אגר 5% SB ו- TSA II 5% SB (טבלת חומרים). סמן כל תווית צלחת עם מזהה המדגם, מיקום הביופסיה והתאריך.
   3. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, הרם מושבה בודדת ופס אותה בתנועת זיג-זג על אותו סוג צלחת שעליו היא זוהתה. לאחר מכן, תוך שימוש באותו קצה פיפטה עם המושבה כתבנית להגברת rDNA PCR של 16 שניות, בצע את השלבים הבאים.
   4. חזור על שלב 2.3.3 באמצעות המושבות שנבחרו מכל סוגי לוחות האגר עם קצה פיפטה סטרילי חדש ומושבה ייחודית שונה של המורפולוגיה המובחנת מהלוח המקורי. שוב, מיד לאחר הפסים, השתמש בקצה הפיפטה עם המושבה שנותרה כדי להטביע אותה בבאר צלחת PCR ייעודית, מכיוון שהדבר יספק תבנית להגברת PCR.
   5. חזור על שלבים 2.3.3-2.3.4 עבור כל מושבה נפרדת עד שכל המושבות עם מורפולוגיות ספציפיות בכל ארבעת סוגי לוחות האגר היו מפוספסות ובארות PCR תואמות חוסנו בו זמנית.
   6. אחסן את צלחות האגר המצופות החדשות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא אנאירובי סגור באריזת CO₂ . לאחר שהמושבות גדלות, הקפידו על טוהר המושבה המבודדת לפני שימור מלאי החיידקים (ראו להלן). אם המושבות המצופות חסרות אחידות, חזור על שלב 2.3.3. בצע את תהליך הציפוי מחדש כל 4-5 ימים, בהתאם לגידול המושבה, עד שהמושבות אחידות במראה.
4. זיהוי מיני חיידקים על ידי ריצוף אמפליקון מושבת rDNA 16s
   1. הכן צלחת PCR עם תערובת מאסטר המורכבת מ-2.5 מיקרוליטר של 10 מיקרומטר 16S rDNA V1-V3 קדימה (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') ופריימרים הפוכים (5' AGAGTTTGATTCCTCTCTCAG-3'; 10 מיקרומטר), 12.5 מיקרוליטר של 2x Master Mix פולימראז ו-10 מיקרוליטר של מים מיקרוביאליים נטולי DNA לבאר לנפח כולל של 25 מיקרוליטר למושבה.
   2. חשב את הנפח של תערובת מאסטר PCR הנדרשת להגברה מכל המושבות שנבחרו, בקרה שלילית (ללא תבנית) ובקרה חיובית - ניתן להשתמש בכל זן מעבדה; אנו משתמשים בדרך כלל ב-Staphylococcus aureus USA300.
   3. הביאו לוחית PCR לארון הבטיחות הביולוגית, המכסה בארות כדי למנוע זיהום. השתמש במושבה אחת מקצה פיפטה סטרילי לציפוי. השעו מיד את המושבה עם מערבולת קפדנית לתוך הבאר המיועדת עם תערובת המאסטר הממולאת מראש. השתמש באותו קצה פיפטה הן לתת-תרבות והן לדגימה עבור PCR.
   4. חזור על שלב 2.4.3 עבור כל מושבות ה-HS הבודדות והבקרה החיובית.
   5. הפעל PCR עם הפרוטוקול הבא: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לדנטורציה ראשונית הנדרשת לליזה של המושבה שנבחרה, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 54 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, השימוש במחזור האחרון של 4 מעלות צלזיוס הוא אופציונלי. ניתן להשתמש בתרמו-סייקלר גם עם אותן הגדרות תוכנית.
   6. הריצו אלקטרופורזה של ג'ל עם מוצרי qPCR מוגברים כדי לאמת את גודל המגבר, שצפוי להיות 311 bp (איור 2). Purify הגבירה בהצלחה שבר rDNA של 16 שניות עם ערכת טיהור ה-PCR לפי הוראות היצרן.
   7. שלח את מוצר ה-PCR המטוהר לריצוף RNA Sanger ריבוזומלי 16S באמצעות פריימרים 16S rDNA V1-V3 קדימה ואחורה.
5. מלאי חיידקים
   הערה: האנאירובים הקפדניים ידועים בכדאיות המוגבלת שלהם על לוחות האגר.
   1. על מנת להבטיח את שימור הזן לפני קבלת תוצאות ריצוף, אשר יאשרו את זהות המינים, ייצרו לוחות אגר ממושבה אחת ויאשרו טוהר ליצירת מלאי. צור מלאי ישירות מלוח האגר במקביל לאופטימיזציה של תנאי הגידול במדיה הנוזלית.
   2. כדי להכין את הציר מהצלחת שנוצרה בשלב 2.3, השתמש בלולאת חיסון סטרילית של 6 מ"מ כדי לאסוף כמה שיותר מושבות אחידות. לאחר מכן, השעו במרץ חיידקים ב-800 מיקרוליטר של RCM עם 20% גליצרול סטרילי בצינורות קריו-צינורות ואחסנו אותם ב-80 מעלות צלזיוס כדי ליצור מלאי חיידקים.
      הערה: שלב זה מבטיח שימור בזמן של פתוגנים קפדניים לפני קבלת אפיון על ידי נתוני ריצוף.
   3. בצע אופטימיזציה של הגידול בתרבות הנוזלית ויצירת מלאי ממושבה אחת לאחר אישור סיווג הזן.

במחקר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ואפיון של חיידקים אנאירוביים ממנהרות HS. פרוטוקול זה הוא חדשני ובולט ביצירת הפוטנציאל לבחון את התפקוד והאלימות של חיידקים אלה באמצעות מודלים של זיהום עור במבחנה, ex vivo ו-in vivo כדי להגביר את ההבנה שלנו לגבי התרומה המיקרוביא?...

במחקר זה, אנו מציגים שיטה חדשה לבידוד ותחזוקה של חיידקים המתיישבים במנהרות HS. שיטה ניתנת לשחזור זו לא רק תאפשר אפיון מעמיק של זנים הקיימים במבנים פתולוגיים אלה, אלא היא גם תאפשר מחקרים פונקציונליים הבאים הבוחנים את תפקידם של חיידקים ספציפיים בפתוגנזה של HS. השלבים הקריטי?...

המחברים לא מדווחים על ניגוד אינטרסים.

עבודה זו נתמכה על ידי R01AR083385 (IP, MTC, HLT), P50MD017347 (TG, IP, HLT) ומענק המחקר של קרן HS דנבי (TG). עבודה זו נתמכה בנוסף על ידי מענק NIH 1S1OD023579-01 עבור בית סורק השקופיות VS120 במתקן הליבה להדמיה אנליטית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיאמי מילר.