Approche globale pour l’isolement microbien des tunnels d’hidradénite suppurée

Nous présentons une méthode permettant d’isoler avec succès des organismes méticuleux et anaérobies des voies sinusales cutanées (tunnels) dans les tissus excisés de patients atteints d’hidradénite suppurée .

L’hidradénite suppurée (HS) est une affection débilitante caractérisée par des nodules et des abcès douloureux, progressant vers les voies sinusales (tunnels) à l’intérieur des couches dermiques de la peau, provoquant une gêne importante, un écoulement nauséabond, une défiguration, des contractures et des cicatrices, qui diminuent gravement la qualité de vie. L’HS est associée à des altérations du microbiome cutané, ce qui a un impact sur la régulation immunitaire et la défense de la peau contre les bactéries nocives. Malgré sa prévalence, la contribution du microbiome HS à la pathologie de la maladie et la réponse limitée au traitement restent largement inconnues. À ce jour, de multiples études de séquençage de l’ARNr 16S sur des tissus HS n’ont atteint qu’une granularité au niveau du genre, identifiant une augmentation des anaérobies à Gram négatif et une diminution des commensaux cutanés. Une compréhension plus approfondie de la dysbiose microbienne chez les personnes atteintes d’HS est essentielle pour optimiser les stratégies de traitement. Cela nécessite une approche à deux volets pour évaluer le microbiome HS, y compris l’isolement des espèces bactériennes, qui sont souvent sous-utilisées dans les études translationnelles axées sur les troubles cutanés. L’isolement des micro-organismes individuels dans les tissus de l’HS est crucial pour élucider le rôle des bactéries dans la pathogenèse de l’HS. Ici, nous mettons en évidence des méthodes reproductibles pour isoler avec succès les agents pathogènes anaérobies du tissu tunnel de l’HS, fournissant l’étape initiale et la plus critique dans la compréhension du rôle bactérien dans l’HS. Cette méthode ouvre la voie à des recherches ciblées sur les contributions microbiennes à l’HS et à l’élaboration de stratégies de traitement plus efficaces et personnalisées qui s’attaquent au fardeau microbien complexe de cette maladie chronique.

L’hidradénite suppurée (HS) est une affection dermatologique courante caractérisée par des nodules et des abcès qui progressent vers les voies sinusales (tunnels) formées dans les couches dermiques et sous-cutanées de la peau, provoquant une douleur importante, produisant des écoulements purulents, une défiguration et des séquelles psychosociales débilitantes ^1,2. L’HS affecte de manière disproportionnée les femmes et les personnes ayant une peau de couleur, émergeant généralement à la fin de l’adolescence ou au début de l’âge adulte². Les symptômes physiques graves de la maladie sont aggravés par son impact psychosocial profond, notamment la dépression, l’anxiété et l’isolement social, qui peuvent gravement diminuer la qualité de vie³. Les tunnels HS formés au stade avancé de la maladie diminuent considérablement les chances de réponse des patients à la thérapie biologique actuellement approuvée, et l’excision chirurgicale reste la seule approche de traitement ^4,5.

De nombreuses études ont caractérisé le microbiome associé aux tunnels HS, montrant une prévalence d’agents pathogènes anaérobies et une abondance réduite de commensaux cutanés ^6,7,8, avec des études récentes identifiant Porphyromonas spp. (type I) et Prevotella spp. (IV) dans les tunnels, entre autres genres⁹. Une autre étude a révélé une variation du microbiome HS en fonction de la profondeur de l’échantillonnage tissulaire, confirmant le caractère unique de la composition microbienne dans le tissu tunnel¹⁰. De plus, il a été démontré que la dysbiose affecte la réponse immunitaire dans l’HS, ce qui implique davantage le rôle des microbes dans la pathogenèse de la maladie 11,12,13,14. Bien qu’un traitement antibiotique systémique prolongé à base de clindamycine, de rifampicine et de tétracyclines soit utilisé et ait montré une réduction du nombre de tunnels de drainage chez les patients atteints^15,16, les données sur les agents pathogènes anaérobies résistants aux antibiotiques dans l’HS restent inconnues. Jusqu’à présent, l’isolement de souches bactériennes dans les tunnels de HS n’a pas été signalé, ce qui limite les études sur les nouveaux traitements antimicrobiens et l’évaluation approfondie de la contribution des agents pathogènes à la pathogenèse de la maladie HS. La normalisation des méthodes d’isolement des agents pathogènes permettrait non seulement de mieux comprendre le rôle des bactéries dans la pathogenèse de l’HS, mais aussi d’orienter vers des interventions plus ciblées et améliorées.

Ici, nous mettons en évidence une méthode permettant d’isoler avec succès les micro-organismes du tissu tunnel HS. L’isolement d’espèces bactériennes individuelles est une première étape cruciale dans la compréhension de leur rôle dans la pathologie de l’HS. Cette méthode ouvre la voie à une recherche ciblée sur les contributions microbiennes à l’HS et à l’élaboration de stratégies de traitement plus efficaces et personnalisées qui s’attaquent aux agents pathogènes bactériens dans cette maladie chronique.

Ce protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Miami (protocole #20200187). Le consentement éclairé est obtenu des patients (n = 18, âge moyen ± écart-type = 30,9 ± 9,4, 12 femmes, 6 hommes) diagnostiqués avec des tunnels HS et/ou leur(s) tuteur(s) légal(s) avant la procédure après une discussion préalable de la recherche afin de permettre de répondre à toute préoccupation ou question.

1. Prélèvement d’échantillons de patients

1. Avant de manipuler des tissus excisés, prendre des précautions strictes en matière de stérilisation afin de minimiser le risque de contamination. La personne qui manipule les tissus doit porter une blouse de laboratoire, un masque facial et une casquette chirurgicale et utiliser des gants stériles et des instruments stériles pour manipuler les tissus.
2. Pour le contrôle de la stérilité, immergez une pince pré-autoclave dans le flacon de transport anaérobie avant de traiter le tissu (Table des matériaux).
3. Prélever du tissu cutané, réséqué chirurgicalement à l’aide d’un scalpel ou d’un laser CO₂ , sur les zones touchées des patients diagnostiqués avec des tunnels HS et le placer immédiatement dans une boîte de Pétri stérile à l’aide d’une pince stérile pour un traitement ultérieur.
4. Au centre de chirurgie ou au cabinet de la clinique externe, identifiez les tunnels dans les tissus excisés en sondant la peau avec une pince pré-autoclave, comme illustré à la figure 1A.
5. Prélever des biopsies à l’emporte-pièce de 6 mm à travers la peau de toute l’épaisseur du tunnel identifié immédiatement après l’excision des tissus et les immerger dans le milieu tamponné semi-solide avec des agents réducteurs dans le système anaérobie, transporter des flacons en verre afin d’optimiser la survie des espèces bactériennes anaérobies pour une analyse plus approfondie.
6. Transporter le tissu du tunnel dans les flacons anaérobies jusqu’au laboratoire sur de la glace.
7. Effectuez un exemple de documentation comme décrit ci-dessous.
   1. Le jour de l’intervention, recueillez des informations sur le patient, y compris les données démographiques, l’âge, l’origine ethnique/la race autodéclarée et les médicaments actuels, sans aucun identifiant personnel. Les sites corporels des tissus réséqués accompagnent un tableau corporel, car des tunnels HS peuvent se produire à plusieurs sites du corps. Prendre des photos des tissus excisés des deux côtés de l’échantillon avant et après le traitement des tissus, en documentant l’emplacement de la biopsie générée à partir d’un tunnel. À l’arrivée au laboratoire, consigner les échantillons de tissus codés sans aucun identificateur personnel dans une base de données électronique sécurisée.

2. Traitement de la peau HS

1. Mise en place et placage
   1. Portez une blouse de laboratoire et des gants, et attachez les cheveux pour éviter toute contamination. Plaques de gélose au sang préchauffées, y compris la gélose au sang de Brucella lacée avec gélose à la kanamycine et à la vancomycine (LKV), la gélose au soja trypticase (TSA II) à 5 % de sang de mouton (SB), la perfusion de cerveau-cœur (BHI) et la gélose à l’alcool phényléthylique (PEA) avec une gélose SB à 5 % à 37 °C dans un incubateur pendant 10 min. Nettoyez l’enceinte de biosécurité avec de l’éthanol à 70 % avant de traiter les tissus.
   2. Une fois les plaques de gélose réchauffées, étiquetez la base ou le côté de la plaque avec le nom de l’échantillon codé et la date. Placez des pinces autoclavées, des scalpels, des anses d’inoculation pré-stérilisées et des plaques de gélose dans l’enceinte de biosécurité.
   3. Retirer la biopsie à l’emporte-pièce de 6 mm du flacon de transport anaérobie à l’aide d’une pince stérile en immergeant la pince dans le milieu. Coupez rapidement le tissu en petits morceaux, d’environ 1 mm² chacun, à l’aide d’un scalpel stérile. Placez le tissu dans un tube de microcentrifugation stérile contenant 500 μL de milieu clostridien renforcé (MCR) et agitez brièvement le vortex.
      REMARQUE : L’homogénéisation n’a pas été utilisée parce que les échantillons auraient été exposés à l’environnement aérobie pendant une période prolongée, ce qui aurait pu entraîner une aération supplémentaire pendant le processus et une perte potentielle de bactéries anaérobies.
   4. À l’aide d’une nouvelle boucle stérile, effectuez des traînées répétées en quadrant de la suspension tissulaire contenant des organismes bactériens sur les plaques de gélose TSA II 5 % SB, LKV, PEA avec 5 % SB et BHI.
   5. À l’aide de la suspension de tissu haché restante, préparez des stocks de glycérol en ajoutant 20 % de glycérol stérile v/v et 80 % de suspension tissulaire v/v dans un cryotube. Conservez les stocks de glycérol à 80 °C. Dans le cas d’une viabilité limitée de bactéries isolées, des stocks de tissus peuvent être utilisés pour répéter l’isolement.
   6. Placez toutes les plaques dans l’incubateur à 37 °C dans une chambre anaérobie fermée par un pack de CO₂ . Vérifiez les plaques tous les 2-3 jours, en vous attendant à une croissance des anaérobies 7 à 14 jours après le placage. Documenter les morphologies des colonies en photographiant des planches.
2. Banque de tissus
   1. Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de 8 mm pour prélever des échantillons de peau supplémentaires de pleine épaisseur à travers le tunnel et loin du tunnel pour l’échantillon de paraffine fixe au formol (FFPE) et l’évaluation histologique, car un échantillon de tissu plus grand est plus susceptible de capturer le tunnel complet.
   2. Conservez des biopsies supplémentaires de 6 mm pour l’ADN (congélation instantanée), l’ARN (dans l’ARN plus tard) et l’isolement des protéines (congélation instantanée).
3. Entretien de la colonie
   1. Une fois les colonies observées sur les plaques d’origine, photographiez les plaques et notez la morphologie distincte de la colonie¹⁷. En général, il faut prévoir 10 à 15 morphologies de colonies différentes (voir figure 1).
   2. Préparez des plaques de gélose LKV, BHI, PEA préchauffées avec 5 % SB et TSA II 5 % SB (Table des matériaux). Étiquetez chaque étiquette de plaque avec le numéro d’identification de l’échantillon, l’emplacement de la biopsie et la date.
   3. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez une seule colonie et tracez-la en zigzag sur le même type de plaque sur laquelle elle a été détectée. Ensuite, en utilisant la même pointe de pipette avec la colonie comme modèle pour une amplification PCR de l’ADNr 16s, suivez les étapes ci-dessous.
   4. Répétez l’étape 2.3.3 en utilisant les colonies sélectionnées dans tous les types de plaques de gélose avec une nouvelle pointe de pipette stérile et une colonie singulière différente de la morphologie distincte de la plaque d’origine. Encore une fois, immédiatement après le streaking, utilisez la pointe de la pipette avec la colonie restante pour l’immerger dans un puits de plaque PCR dédié, car cela fournira un modèle pour l’amplification PCR.
   5. Répéter les étapes 2.3.3 à 2.3.4 pour chaque colonie distincte jusqu’à ce que toutes les colonies présentant des morphologies spécifiques dans les quatre types de plaques de gélose aient été striées et que les puits de PCR correspondants aient été inoculés simultanément.
   6. Conservez les plaques de gélose nouvellement plaquées dans l’incubateur à 37 °C dans une chambre anaérobie fermée par un emballage de CO₂ . Une fois que les colonies se développent, assurez-vous de la pureté de la colonie isolée avant de préserver les stocks bactériens (voir ci-dessous). Si les colonies plaquées manquent d’uniformité, répétez l’étape 2.3.3. Effectuez le processus de replacage tous les 4 à 5 jours, en fonction de la croissance des colonies, jusqu’à ce que les colonies aient un aspect uniforme.
4. Identification d’espèces bactériennes par séquençage d’amplicon de colonie d’ADNr 16s
   1. Préparez une plaque de PCR avec un mélange maître composé de 2,5 μL d’ADNr 10 μM V1-V3 direct (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') et d’amorces inverses (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3' ; 10 μM), 12,5 μL de polymérase Master Mix 2x et 10 μL d’eau exempte d’ADN microbien par puits pour un volume total de 25 μL par colonie.
   2. Calculer le volume d’un mélange maître PCR requis pour l’amplification de toutes les colonies sélectionnées, le contrôle négatif (pas de modèle) et le contrôle positif - n’importe quelle souche de laboratoire peut être utilisée ; nous utilisons couramment Staphylococcus aureus USA300.
   3. Apportez une plaque PCR dans l’enceinte de biosécurité, en couvrant les puits pour éviter toute contamination. Utilisez une seule colonie à partir d’une pointe de pipette stérile pour le placage. Remettez immédiatement la colonie en suspension avec un tourbillon rigoureux dans le puits désigné avec le mélange maître prérempli. Utilisez la même pointe de pipette pour la sous-culture et l’échantillonnage pour la PCR.
   4. Répéter l’étape 2.4.3 pour toutes les colonies de HS individuelles et les témoins positifs.
   5. Exécutez la PCR avec le protocole suivant : 95 °C pendant 5 min pour la dénaturation initiale nécessaire à la lyse de la colonie sélectionnée, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, 54 °C pendant 1 min, l’utilisation du cycle final de 4 °C est facultative. Un thermocycleur peut également être utilisé avec les mêmes paramètres de programme.
   6. Effectuez une électrophorèse sur gel avec des produits qPCR amplifiés pour vérifier la taille de l’amplicon, qui devrait être de 311 pb (Figure 2). Purify a amplifié avec succès le fragment d’ADNr 16s avec le kit de purification PCR conformément aux instructions du fabricant.
   7. Envoyez le produit PCR purifié pour le séquençage de Sanger de l’ARN ribosomique 16S à l’aide d’amorces directes et inverses de l’ADNr 16S V1-V3.
5. Souches bactériennes
   REMARQUE : Les anaérobies fastidieux sont connus pour leur viabilité limitée sur les plaques de gélose.
   1. Afin d’assurer la préservation de la souche avant d’obtenir les résultats du séquençage, qui confirmeront l’identité de l’espèce, générer des plaques de gélose à partir d’une seule colonie et confirmer la pureté pour générer des stocks. Générer des stocks directement à partir de la plaque de gélose en parallèle de l’optimisation des conditions de croissance dans le milieu liquide.
   2. Pour préparer le stock à partir de la plaque générée à l’étape 2.3, utilisez une boucle d’inoculation stérile de 6 mm pour prélever autant de colonies uniformes que possible. Ensuite, réinsérez vigoureusement les bactéries dans 800 μL de MCR avec 20 % de glycérol stérile dans des cryotubes et stockez-les à -80 °C pour créer un stock bactérien.
      REMARQUE : Cette étape permet d’assurer la conservation en temps opportun des agents pathogènes exigeants avant d’obtenir la caractérisation par séquençage des données.
   3. Optimiser la croissance en culture liquide et la génération de stocks à partir d’une seule colonie une fois la classification de la souche confirmée.

Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour l’isolement et la caractérisation des bactéries anaérobies dans les tunnels HS. Ce protocole est nouveau et remarquable en ce qu’il offre le potentiel de tester la fonction et la virulence de ces bactéries à l’aide de modèles d’infection cutanée in vitro, ex vivo et in vivo afin d’accroître notre compréhension de la contribution microbienne à la pathogenèse de l’HS. Tout d’abord, nous...

Dans cette étude, nous présentons une nouvelle méthode pour isoler et maintenir les bactéries colonisant les tunnels HS. Cette méthode reproductible permettra non seulement de caractériser en profondeur les souches présentes dans ces structures pathologiques, mais aussi d’étudier ultérieurement le rôle de microbes spécifiques dans la pathogenèse de l’HS. Les étapes critiques du protocole comprennent la collecte et le transport de tissus dans des milieux anaérobies, ce q...

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Ce travail a été soutenu par R01AR083385 (IP, MTC, HLT), P50MD017347 (TG, IP, HLT) et la subvention de recherche Danby de la Fondation HS (TG). Ce travail a également été soutenu par la subvention NIH 1S1OD023579-01 pour la maison du scanner de lames VS120 à la plate-forme d’imagerie analytique de la Miller School of Medicine de l’Université de Miami.