עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA107469, R01 CA125577, וU01CA154224 לCG Kleer, האוניברסיטה של ​​סרטן מרכז התמיכה של מישיגן.

1. הכנת החומרים ותרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם גדילת הפשרה מופחת (GFR) Matrigel על 4 מעלות CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם מדיה מלאה לשורת תאים הנדרשת על 37 ° C. MCF10A-ATCC שצוינה בתקשורת; המדיום של HME-Ham-F-12 בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס מיליליטר, ו100 רעלן הכולרה ng / מיליליטר; התקשורת של SUM149-Ham-F-12 FBS בתוספת 5%, 2 הידרוקורטיזון מיקרוגרם / מיליליטר ו 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; ומד&quot;א-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool שקופיות קאמריות 8 היטב על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכסה המנוע בתרבית רקמה ואספקה. </li></ol> 2. שלוש ממדי תרבות ב8 היטב שקופיות קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל היטב בכל שקופית 8 היטב עם 40 μl של GFR Matrigel. הוסף את Matrigel במרכז השקופית ולאחר מכן להפיץ באמצעות פיפטה קצה P200. נסה להפיץ בצורה שווה ככל האפשר, תוך הימנעות בועות ופורשים אשר יכול להובילהיווצרות מניסקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות ב37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2. בעוד Matrigel הוא החיזוק, trypsinize התאים, לאסוף ולסובב ב XG 150 בצנטריפוגה תרבית רקמה למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ו לדלל את 12,500 תאים / מיליליטר בתקשורת של הקו הסלולרי בהתאמה מלאה. הוספת GFR Matrigel עד 2% ולהוסיף 400 μl היטב בכל חדר שקופיות Matrigel precoated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בחממת CO 2. תן שינויי מדיה שלמים טריים כל יום 4 עד ה 15 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול במעכבים תרופתיים: ללימודי מעכב להוסיף מעכבי מולקולה קטנים לתקשורת להשלים בזמן ציפוי אחרי שינויי תקשורת טריים בתוספת מעכבים כל שלושה ימים בזמן שהולכים וגדלו תאים על GFR Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול עם חלבון מטוהר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים הבאים על השלבים 2.1-2.3. אפשר התרבויות לגדול במשך 4 ימים ואחריו starvati סרוםל16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, טיפול בתאים עם ריכוז מתאים של חלבון מטוהר ב0.1% FBS בתוספת תקשורת לתאים מורעבים בסרום. תן שינוי תקשורת טרי עם חלבון מטוהר אחרי 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 10 להחליף את התקשורת ממוזגת עם תקשורת HME מלאה. אפשר התרבויות לגדול לעוד 5 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence של מבני acinar גדלו על Matrigel: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן paraformaldehyde 2%, 0.5% טריטון X-100 ו100 גליצין מ&quot;מ 1x PBS, pH 7.4. הכן את חיץ immunofluorescence (IF חיץ) שכולל של 1x PBS המכילים 0.1% אלבומין בסרום שור, 0.2% X-100 טריטון, Tween-20 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה P200 כדי לשאוב את התקשורת המותנה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את מבני acinar עם 2% paraformaldehyde מוכן טרי בטמפרטורת חדר (RT) עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם 0.5% טריטון X-100 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התרבותזמנים של שלושה עם גליצין 100 מ&quot;מ, 10-15 דקות לכל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את התאים עם 10% נסיוב עזים במאגר אם, בשם בלוק ראשוני, במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות עם עכבר אנטי 20 מיקרוגרם / עז מיליליטר F (ab &#39;) 2 שבר במאגר בלוק העיקרי ל30 דקות. שלב זה חשוב כדי לחסום את מיני IgG עכבר immunoreactive בMatrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני בפתרון החסימה השני (עכבר אנטי +20 / מיליליטר עז בלוק ראשי מיקרוגרם F (ab &#39;) 2 שבר) O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם חיץ IF עבור 10-15 דקות כל אחד עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדני ניאון מצומדות משניים בIF חיץ 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף 10 דקות כל אחד עם חיץ IF עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות עם מגיב אנטי לדעוך מכיל DAPI לדמיין את הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות לייבוש O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונה: לרכוש תמונות confocal במיל המושבהdsection של תאים שגודל על גבי Matrigel. לקבלת מידע נוסף לרכוש סדרה של סעיפים אופטיים לאורך כל אורכו של מבנה acinar ידי לערום Z. </li></ol></li></ol> 3. שלוש ממדי תרבות ב2 היטב לשכת שקופיות לimmunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool שקופיות קאמריות 2 היטב על קרח. בצע את פעולות 2.1-2.4 דרוג את ריאגנטים לחדר שקופיות למשל מעיל 2 היטב עם 160 μl של Matrigel ולהוסיף 1.6 מיליליטר של התא / Matrigel לערבב היטב בכל השקופית 2 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר מבני acinar מMatrigel באמצעות ערכת קצירת תא תרבות 3D זמינה המסחרית בעקבות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המאגרים לשטוף תא וקציר התא ל1x וprecool עד 4 ° C. כביסה ודחיקה של Matrigel צריכה להתבצע על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מבני acinar 3x באמצעות החיץ לשטוף תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף acini ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות bu קצירת תאffer ואחריו 30 דגירה דקות על כיסא נדנדה ב 4 ° C. מערבבים את ההשעיה גם עם טפטפת 1 מיליליטר. זה ישבור את Matrigel בחתיכות קטנות ולשחרר את רוב התאים במאגר קצירת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב XG 200 בצנטריפוגה בתרבות. הסר את השכבה הצפה של הידרוג&#39;ל מתאי pelleted עם קצה פיפטה P200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend lysates בחיץ מדגם SDS מצורף לערכה. יכול לשמש גם מאגר תמוגה ריפה. </li></ol> 4. כימות של הפנוטיפ שד שפיר לעומת ממאיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בtriplicates עבור כל קבוצת טיפול בעקבות צעדי 2.1-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמונות בניגוד שלב של מבני acinar מכל הטוב ב5X או 10X רזולוציה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב מצורף למחלף שקופיות ומחשב. קח את התמונות על ידי העברת השקופיות מפריים אחד למשנהו ובכך מכסים את כולו גם של שקופית תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של מבני acinar,מספר acini אחת עגול ושטוח ומספר מבני multiacinar או המבנים גדל באקראי חסר ארגון ועם תהליכי הסתעפות הבוקעים ממנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז המבנים בודדים עגולים acinar השטוח לעומת המבנים ממאירים ועלילה כגרף עמודות. לחשב את המשמעות על ידי מבחן t של הסטודנט. </li></ol>

<ol>
	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li><li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li><li>Rosen, P. P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

שתארנו כאן התרבות תלת ממדים של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש ואת השימושיות של מערכת זו כדי להבדיל בין פנוטיפ שפיר בשד לעומת ממאיר. גם מערכת זו יכולה לשמש לתרבות סוגי תאים שונים מרקמות בלוטות אחרות וכבר דווחה כי שימשה בהצלחה לאפיתל ערמונית התרבות, אפיתל הסימפונות, ות...

שלוש תרבות ממדי (3D) של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש היא מערכת מודל חשובה ללמוד את הפנוטיפ המורכב והאיתות קשורה של שד נורמלי וסרטן השד 2,3. היחידה התפקודית של שד היא יחידת מסוף צינור lobular (TDLU) אשר מורכבת מצינור קטן שסניפים לacini. Acini הם מבנים מאורגנים מאוד, מורכב משתי שכבות תאים, תאי אפיתל וmyoepithelial, אשר מוקפות בקרום במרתף 5. התכונות הייחודיות ביותר של acini הנורמלי הן קיטוב סלולארי, קובץ מצורף לקרום במרתף המשמש כבסיס וקשר מיוחד תאי תאים. ארגון מורכב זו מופר בקרצינומות פולשנית. תרבויות 2D בשימוש נרחב, שבו תאים גדלים כמו monolayers, אל תאפשר להיווצרות של acini. לפיכך, תרבות monolayer חסרה במתן מערכת כדי ללכוד את מערכת היחסים המורכבות שבין תאי האפיתלבשד נורמלי והסרת הפיקוח שלהם בסרטן השד. תרבויות אפיתל monotypic תפקודיות של תאי שד פותחו במספר מעבדות 2,3. תרבות 3D כוללת את הצמיחה של תאי שד על Matrigel, שהוא תמצית solubilized שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל והוא זמין באופן מסחרי. מצע 3D אחר כמו קולגן אני גם נמצא בשימוש. יכולים להיות מתורבת תאי השד ב-3D ​​על ידי assay 3D המשובץ, שבו תאים בתרבית מוטבעת בMatrigel 2. לחלופין, יכולים להיות מתורבת תאים על ידי 3D על assay העליון, המכונים גם assay כיסוי 3D, אשר הוא עלות האפקטיבית כפי שהוא דורש נפח קטן יותר של Matrigel, ומאפשר ניטור זמן לשגות של הקמת מושבה על ידי הדמיה בניגוד שלב והוא אידיאלי באתר הדמיה 2 -3. 3D על assay העליון נעשה שימוש כדי להגדיר את המתאם בין פנוטיפ acinar ופרופיל ביטוי גני 7. תרבות 3D ניתן effectivאיליי משמש להבחנה בין תאים נורמלים ושפירים מקרצינומה פולשנית. תאי שד נורמלים ושפירים בצורת צמיחה נעצרה מבנים מקוטבים עם לומן מוגדר היטב במרכז בMatrigel ואילו תאי קרצינומה פולשנית לגדול בשפע ואקראי ללא סליקה של לומן. E6/E7 הונצח תאים אנושיים אפיתל החלב וקו סלולרי MCF10A, שהוא קו סלולרי הונצח באופן ספונטני שבודד מחולה 36 שנה ישנה עם שינויי fibrocystic, שימש בהצלחה לשחזר את הפנוטיפ שפיר בשד ב3D 3,8 ושמש מערכת מודל ללמוד את התפקיד המדכא בשעור וגידול של מספר מולקולות 8,9. יכול להיות מהונדסים לתאים שפירים אלה כדי לתפעל גן (ים) של עניין על ידי ההקדמה של lentivirus / רטרווירוס. אם הגן (ים) של עניין הוא מדכאי סרטן, מציאה shRNA תיווך תוביל לשינוי ממאיר ואילו אם הגן של עניין הוא ביטוי יתר של אונקוגן בתאים שפיריםצריך להראות פנוטיפ ממאיר. בשני המקרים מבני acinar נוצרו ב3D יכולים ללכוד את השינוי הממאיר. תאים בודדים שפירים מצופים ב3D להתחיל להתרבות וליצור סביב מבנים כדוריים. ביום 5-8 במצטבר כדורי זה של תאים להתמיין לשכבה המקיפה מקוטבת של תאים שנמצאת במגע עם Matrigel, ומסה פנימית של תאים פחות מקוטבים, אשר חוסר מגע עם Matrigel. בימים הקרובים 10-15 התאים הפנימיים יתחילו למות על ידי אפופטוזיס להרכיב לומן ברור. התאים הממאירים יגדלו באקראי לאבד את הקוטביות שלהם. תאים מאוד ממאירים בדרך כלל בצורת הסתעפות מבנים. הבדלים אלה בפנוטיפ יכולים להיות שנתפסו על ידי הדמיה בניגוד שלב זמן לשגות ועל ידי באתר immunostaining עם סמנים מולקולריים רלוונטיים. הסמנים הנפוצים ביותר הם אלפא 6 integrin, סמן קוטביות בסיסי, בשילוב עם סמן התפשטות phospho-היסטון 3 וapoptotסמן ic ביקע caspase-3. זו האחרונה היא חשובה כדי לקבוע אם יש היווצרות לומן במרכז acini, תכונה של תאי שד נורמלים ושפירים. סמני קוטביות וקשר תאי תאים אחרים כוללים GM130, laminin, ERM, E-cadherin. לחלופין יכולות להיות מהונדסות שורות תאי סרטן השד כדי לתפעל את הגן של עניין. במקרה הזה חזרה לצמיחה יותר נעצרה פנוטיפ השפיר יכול לשמש כהקריא להבחין בין פנוטיפ הסרטן. גם תרבות 3D ניתן להשתמש בזהירות כדי להתוות את מסלולי האיתות מעורבים בשינוי ממאיר 10-11. שימוש שהוזכר לעיל לקרוא-outs, מעכבים תרופתיים, נוגדני חסימה או חלבונים רקומביננטיים יכול לשמש להיות להצביע באיתות המולקולרית המובילה לשינוי ממאיר. עם מאמצים מתמשכים ממעבדות שונות שניתן לחלץ התאים מ3D לבודד RNA וגם להכין lysates לimmunoblotting אימונוגלובולינnoprecipitation. אסטרטגיות אלה מתוארות בשלבים ובאופן מפורט בפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>Avoid repeat freeze thaw&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402</td><td>Precool on ice&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek glass chamber slides 2-well&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td>Precool on ice&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Goat anti mouse F(ab&amp;acute;)&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;fragment</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Please look at molecular probes website</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>3D Culture Cell Harvesting kit</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Apha-6-integrin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MAB1378</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td><td>Cell Signaling</td><td>9661s</td><td>1:50 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>1:200 dilution for IF</td></tr></tbody></table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

קרצינומות שד פולשני הן קבוצה של גידולי אפיתל ממאירים מאופיינת בחדירה לרקמות סמוכות ונטייה לגרורות. משחק הגומלין של אותות בין תאים סרטניים והמיקרו שלהם השפעה חזקה על צמיחת סרטן השד והתנהגות 1 ביולוגית. עם זאת, רובם של אותות הבאים מהמטריצה ​​תאית אבדו או את הרלוונטיות שלהם היא understudied כאשר תאים גדלים בשתי תרבות ממדית (2D) כשכבה. בשנים האחרונות, שלוש תרבות ממדים (3D) בקרום במרתף מחדש התפתחה כשיטת בחירה לשחזר את ארכיטקטורת הרקמה של תאים בשד שפירים וממאירים. תאים שגודלו ב3D לשמר את הרמזים החשובים מהמטריצה ​​תאית ולספק לשעבר vivo 2,3 מערכת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ראוי לציין, שיש ראיות הולכות ומצטברים מצביעים על כך שהתאים מתנהגים בצורה שונה כאשר גדלו ב3D לעומת 4 2D. תרבות 3Dניתן להשתמש ביעילות כאמצעי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד ושבסיס האיתות התאית ומולקולרית מעורב 3. אחד מסימני ההיכר של תאי אפיתל השפירים הוא שהם מקוטבים כך שהציטופלסמה הפסגה היא לכיוון הלום וציטופלסמה הבסיסית נשענת על הקרום במרתף. קוטביות apico-הבסיסי הזה אבוד, בקרצינומות שד פולשני, המתאפיינים בחוסר ארגון והיווצרות anastomosing והסתעפות צינוריות שאקראי מחלחל stroma סביב סלולריים. הבדלים אלה בין histopathological בלוטה שפירה וקרצינומה פולשנית יכולים להיות מועתק ב3D 6,7. שימוש בקריאת פסקי המתאימים כמו לכמת את מבני acinar סיבוב בודדים, או דיפרנציאלי ביטוי של סמנים מולקולריים תוקף להתפשטות תאים, קוטביות ואפופטוזיס בשילוב עם טכניקות אחרות מולקולריות וביולוגיה של תא, תרבות 3Dדואר יכול לספק כלי חשוב כדי להבין טוב יותר את השינויים התאיים בשינוי ממאיר ומגדיר את האיתות אחראית.

תרבות 3D ניתן להשתמש ביעילות כדי לבדל את הפנוטיפ ממאיר של תאי אפיתל שד אנושיים מהשד השפיר. תאים שפירים יחיד מצופים על Matrigel לגדול כמבנים כדוריים מאורגנים שיכול בקלות להיות צילמו כacini שטוח סיבוב בודד במישור אחד באמצעות הדמיה בניגוד שלב. התאים הממאירים בודדים מצופים על Ma...

Watch this Scientific Journal Video about Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells at JoVE.com

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

three-dimensional-cultures-tool-to-study-normal-acinar-architecture

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

19.8K Views.  University of Michigan Comprehensive Cancer Center.  שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות. 

Video: Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Cancer Research

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been provided by studies using these models. Cell lines have provided an understanding of the deregulation of molecular signaling associated with breast tumorigenesis, while rodent models are widely used to study cellular and molecular characteristics of breast cancer in vivo. The establishment of 3D cultures of breast epithelial and cancerous cells aids in bridging the gap between in vivo and in vitro models by mimicking the in vivo conditions in vitro. This model can be used to understand the deregulation of complex molecular signaling events and the cellular characteristics during breast carcinogenesis. Here, a 3D culture system is modified to study a phospholipid mediator-induced (Platelet Activating Factor, PAF) transformation. Immunomodulators and other secreted molecules play a major role in tumor initiation and progression in the breast. In the present study, 3D acinar cultures of breast epithelial cells are exposed to PAF exhibited transformation characteristics such as loss of polarity and altered cellular characteristics. This 3D culture system will assist in shedding light on genetic and/or epigenetic perturbations induced by various small molecule entities in the tumor microenvironment. Additionally, this system will also provide a platform for the identification of novel as well as known genes that may be involved in the process of transformation.

The present protocol describes the setting up of 3D 'on top' cultures of a non-transformed breast epithelial cell line, MCF10A, that has been modified to study Platelet Activating Factor (PAF) induced transformation. Immuno-fluorescence has been used to assess the transformation and is discussed in detail.

מתווך פוספוליפידים המושרה טרנספורמציה בתרבויות תלת מימדיות

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Bioengineering

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Developmental Biology

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...