פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מראה מתודולוגיה שלב אחר שלב לבידוד אפיתל הרחם הטהור ביותר מרחם העכבר לתרבית של אורגנואידים רירית הרחם. שיטה זו משתמשת ביעילות בדיסוציאציה אנזימטית ומכנית כדי לבודד אפיתל הרחם. הטכניקות יועלו כדי לבסס, לטפל ולנתח אורגנואידים אפיתל רירית הרחם שמקורם באפיתל המבודד.
יש להתחיל בהפשרת מטריצת הג'ל על הקרח למשך כשעה עד שעתיים לפני השימוש. לאחר מכן נתחו את העכבר המומת על ידי ביצוע חתך בקו האמצע על הבטן באמצעות מספריים, וקילוף עדין של העור לאחור כדי לחשוף את שכבת הצפק שמתחת. אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה והחזק את קרני הרחם בצומת צוואר הרחם לפני חיתוך אותם לאורך השומן המזנטרי.
לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים. לאחר הסיום, חותכים כל קרן רחם לשברים קטנים, שכל אחד מהם מודד כארבעה עד חמישה מילימטרים. מניחים את כל שברי הרחם מרחם אחד לבאר אחת מתוך צלחת 24 באר המכילה 0.5 מיליליטר של 1% טריפסין.
לאחר מכן דגרו את צלחת 24 הבאר באינקובטור תרבית רקמה לח של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה להפרדה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם מהסטרומה שמתחת. לאחר הדגירה, מעבירים את שברי הרחם לצלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של תמיסת אגירת פוספט של דולבקו או DPBS. לאחר מכן, הפרד את אפיתל הרחם מצינור הרחם תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי החזקת קצה אחד של שבר הרחם עם המלקחיים והפעלת קצה הפיפטה בעדינות לאורך השבר, סחיטת האפיתל מהקצה השני של צינור הרחם.
לאחר מכן התבונן ביריעות האפיתל המופרדות מקטע הרחם תחת מיקרוסקופ הנתיחה. לאחר מכן, בעדינות להעביר את כל יריעות אפיתל לתוך אותו צינור 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה מיליליטר אחד. ו גלולה את יריעות אפיתל מנותקות על ידי צנטריפוגה ב 375 x גרם במשך חמש דקות.
הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא והשהה את כדור התא ב-0.5 מיליליטר של 2.5 מיליגרם למיליליטר קולגן ועוד שני מיליגרם למיליליטר של תמיסת DNA. פיפטה למעלה ולמטה כ-10 פעמים או עד להשגת השעיה של תא בודד. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של DMEM F/12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי או FBS בתוספת אנטיביוטיקה וצנטריפוגה של התאים במשך חמש דקות ב-375 x גרם.
הסר את הסופר-נטנט, השהה את התאים במיליליטר אחד DMEM/F12 בתוספת 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה וצנטריפוגה של התאים. מניחים את מטריצת הג'ל על קרח עד שהיא מוכנה. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט מתאי הצנטריפוגה והשעה מחדש את גלולת התא תוך שימוש בנפח של פי 20 מנפח מטריצת הג'ל מבלי להציג את הבועות.
אפשרו לתרחיף תא המטריצה של הג'ל לשקוע בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. ברגע שתרחיף תא מטריצת הג'ל הופך לג'ל מוצק למחצה, השתמש במיקרופיפט P200 עם קצה רחב של 200 מיקרוליטר ושאף בעדינות 25 מיקרוליטר של תרחיף תא מטריצת הג'ל. יש לחלק שלוש כיפות נפרדות של 25 מיקרוליטר לכל באר של צלחת 12 באר ולאפשר למטריצת הג'ל לרפא במשך 15 דקות ואינקובטור תרבית רקמה לחות של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שמטריצת הג'ל נרפאת, הוסיפו 750 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי לכל באר המכילה כיפת מטריצת ג'ל, ואינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של תרבית רקמה לחה. תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים של רירית הרחם של עכברים הראו כי הפרדת התאים האפיתל והסטרומליים הניבה דגימות עם לא יותר מ-10% עד 15% זיהום של סוג התא הנגדי. תאי אפיתל רירית הרחם הורכבו לאורגנואידים תוך שלושה עד ארבעה ימים.
האורגנואידים הקבועים של פורמלין פרפין משובצים בחתך הודגמו על ידי כתמי המטוקסילין ואאוזין, שהציגו את השכבה היחידה של אפיתל ומרכזים חלולים, הלומן של האורגנואידים. הדמיית המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הראתה כי כל התאים באורגנואידים היו ציטוקרטין 8-חיובי והכילו DAPI, מה שמצביע על כך שקיבוע, הטבעה ועיבוד של האורגנואידים רירית הרחם תואמים לאימונוסטינינג מבוסס נוגדנים. ה-PCR הכמותי בזמן אמת הראה כי הגירוי עם 10 אסטרדיול ננומולרי הגביר את הביטוי של ליפוקלין 2, לקטופרין וקולטן פרוגסטרון באורגנואידים האפיתליים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם כדי למדוד את השינויים בביטוי הגנים בתגובה לאסטרדיול.
חשוב לוודא כי הפרדה ברורה של אפיתל רירית הרחם מתקבלת במהלך שלב הדיסוציאציה המכנית. יש להיות מסוגלים להתבונן באפיתל היוצא מצינור הרחם. שיטות אחרות כוללות הקמת אורגנואידים אפיתל על ידי אנקפסולציה לתוך מטריצת ג'ל.
אם תרצה, ניתן לעכל עוד יותר את התא הסטרומלי כדי ליצור תרביות שיתוף סטרומליות אפיתל תלת-ממדיות. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות על האותות השולטים בחידוש רירית הרחם. זה יכול לעזור לטפל במחלות אצל נשים, כגון אנדומטריוזיס, אובדן הריון וסרטן.
