Bu protokol, endometriyal organoidlerin kültürü için fare uterusundan oldukça saf uterus epitelini izole etmek için adım adım bir metodoloji gösterdiği için önemlidir. Bu yöntem, uterus epitelini izole etmek için enzimatik ve mekanik ayrışmayı verimli bir şekilde kullanır. Teknikler, izole epitelden türetilen endometriyal epitel organoidlerini oluşturmak, tedavi etmek ve analiz etmek için kolaylaştırılmıştır.
Jel matrisini kullanımdan yaklaşık bir ila iki saat önce buz üzerinde çözerek başlayın. Daha sonra makas kullanarak karın üzerinde bir orta hat kesisi yaparak ötenazi fareyi disseke edin ve altta yatan periton tabakasını ortaya çıkarmak için cildi yavaşça geri soyun. Karın yağ pedlerini hafifçe bir kenara iterek uterus boynuzlarını bulun ve mezenterik yağ boyunca kesmeden önce uterus boynuzlarını servikal kavşakta tutun.
Fare uterusunun diseksiyonunu takiben, uterus boynuzundan yağ dokusunu küçük makasla iyice çıkarın. Bir kez bittiğinde, her uterus boynuzunu her biri yaklaşık dört ila beş milimetre ölçülen küçük parçalara ayırın. Tüm uterus parçalarını bir uterustan 0.5 mililitre% 1 tripsin içeren 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin.
Daha sonra, endometriyal epitelin altta yatan stromadan enzimatik olarak ayrılması için 24 kuyucuk plakasını 37 santigrat derece nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe yaklaşık bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, uterus parçalarını bir mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisi veya DPBS içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü plakasına aktarın. Daha sonra, uterus epitelini bir diseksiyon mikroskobu altında uterus tüpünden ayırın, bir uterus parçasının bir ucunu forseps ile tutarak ve pipet ucunu parça boyunca uzunlamasına yavaşça çalıştırarak epiteli uterus tüpünün diğer ucundan sıkın.
Daha sonra diseksiyon mikroskobu altında uterus fragmanından ayrılmış epitel tabakalarını gözlemleyin. Daha sonra, bir mililitrelik pipeti kullanarak tüm epitel tabakalarını nazikçe aynı 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Ve ayrışmış epitel tabakalarını beş dakika boyunca 375 x g'de santrifüjleme ile pelet edin.
Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini mililitre kollajenaz başına 0.5 mililitre 2.5 miligram artı mililitre DNA çözeltisi başına iki miligram içinde yeniden askıya alın. Pipetleri yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı veya tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar yukarı ve aşağı doğru yapın. Daha sonra, 0.5 mililitre DMEM F / 12 artı% 10 fetal sığır serumu veya FBS artı antibiyotik ekleyin ve hücreleri 375 x g'de beş dakika boyunca santrifüj edin.
Süper nantantı çıkarın, hücreleri bir mililitre DMEM / F12 artı% 10 FBS artı antibiyotiklerle yeniden askıya alın ve hücreleri santrifüj edin. Jel matrisini hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, süpernatantı santrifüj hücrelerinden çıkarın ve kabarcıkları sokmadan jel matrisinin hacminin 20 katını kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın.
Jel matris hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Jel matris hücresi süspansiyonu yarı katı bir jel haline geldiğinde, geniş delikli 200 mikrolitre uçlu bir P200 mikropipet kullanın ve jel matris hücresi süspansiyonunun 25 mikrolitresini nazikçe aspire edin. 12 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına üç ayrı 25 mikrolitre kubbe dağıtın ve jel matrisinin 15 dakika boyunca kürlenmesini ve 37 santigrat derece nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörünü bırakın.
Jel matrisi kürlendikten sonra, jel matris kubbesi içeren her bir kuyucuğa 750 mikrolitre organoid ortam ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübatör ekleyin. Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleri, epitel ve stromal hücre ayrımının, karşı hücre tipinin% 10 ila% 15'inden fazla kontaminasyonu olmayan örnekler verdiğini göstermiştir. Endometriyal epitel hücreleri üç ila dört gün içinde organoidlere birleştirildi.
Kesitli formalin sabit parafin gömülü endometriyal organoidler, tek bir epitel tabakası ve içi boş merkezleri, organoidlerin lümenlerini gösteren hematoksilin ve eozin lekeleri ile görselleştirildi. Floresan mikroskop görüntülemesi, organoidlerdeki tüm hücrelerin Sitokeratin 8-pozitif olduğunu ve DAPI içerdiğini, endometriyal organoidlerin fiksasyonunun, gömülmesinin ve işlenmesinin antikor bazlı immünoboyama ile uyumlu olduğunu göstermiştir. Gerçek zamanlı kantitatif PCR, 10 nanomolar estradiol ile stimülasyonun, epitel organoidlerinde lipokalin 2, laktoferrin ve progesteron reseptörü ekspresyonunu arttırdığını gösterdi ve endometriyal epitel organoidlerinin, östradiol'e yanıt olarak gen ekspresyon değişikliklerini ölçmek için başarıyla kullanılabileceğini gösterdi.
Mekanik ayrışma adımı sırasında endometriyal epitelin net bir şekilde ayrılmasını sağlamak önemlidir. Rahim tüpünden çıkan epitel gözlemlenebilmelidir. Diğer yöntemler, epitel organoidlerinin bir jel matrisine kapsüllenerek oluşturulmasını içerir.
İstenirse, stromal bölme 3D epitelyal stromal ko-kültürler oluşturmak için daha da sindirilebilir. Yöntem, endometriyumun yenilenmesini kontrol eden sinyallerle ilgili soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Endometriozis, hamilelik kaybı ve kanser gibi kadınlarda hastalığın tedavisine yardımcı olabilir.
