אנו מתארים אסטרטגיות ופרוטוקולים שלב אחר שלב כדי להקים אורגנואידים סדרתיים שמקורם בחולים תלת-מימדיים של סרטן הערמונית גרורתי בעצמות. הפרוטוקולים האופטימיים שלנו הם מעשיים כדי להגדיר תרביות 3D לניסויים באמצעות חומר התחלתי מוגבל ישירות מחולים או רקמות גידול שנגזרו על ידי המטופל. האורגנואידים 3D מפרוטוקול זה יכול לשמש מודלים ex vivo להבין מנגנונים בסיסיים של פתולוגיה סרטן הערמונית גרורתי עצם כדי לבדוק את הטיפול.
מדיית תרבות האורגנואידים תלת-מימדית בפרוטוקול זה ספציפית לתאים שמקורם בערמונית. חלקים אחרים של הפרוטוקולים שלנו חלים על סוגים שונים של רקמות הגידול ואתרים גרורתיים. טכניקת הדומינג עשויה להתברר כחלק הקשה ביותר בתהליך זה.
תרגול טכניקת ההדמיה יבטיח גודל עקבי של תערובת הכיפה של אורגנואידים, מדיה, ו Matrigel, ולמזער היווצרות בועה במהלך השעיה מדגם. הדגמה חזותית של שיטה זו מספקת הבנה טובה יותר של אופן האופן שבו ניתן לטפל במטריגל הקרבי לצורך טיפול מוצלח באורגנואידים בצפיפות נמוכה ממספר נמוך של תאים. התחל על ידי שימוש חוזר את גלולת התא בנפח המתאים של קרום מרתף עבור התקנה צלחת 24 היטב.
פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי להבטיח כי התאים הם resuspended, ולאחר מכן pipette את הנפח המתאים של ההשעיה התא למרכז צלחת תרבות רקמה מחוממת מראש. להפוך את הצלחת מיד למקם אותו במהופך באינקובטור תרבות התא להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 15 דקות. פיפטה הנפח המתאים של מדיום מחומם מראש המכיל 10 מיקרומולר Y-27632 דיהידרוכלוריד לתוך כל באר.
כדי ליצור כיפה צפה מהכיפה העגולה המחוברת, נתק את הכיפה מהצלחת באמצעות מגרד תאים. חותכים חתיכה של שניים על ארבעה אינץ ' של סרט פרפין ומ מניחים אותו על גבי divots של מתלה מחזיק קצה ריק מתיבת קצה פיפטה פלסטיק מיליליטר אחד. השתמש באצבע המורה כפפות בעדינות ללחוץ על הסרט פרפין כדי לעקוב אחר divots דואג לא לפרוץ את הסרט.
לרסס את הסרט פרפין עם 70% אתנול ולהדליק את מנורת UV במכסה המנוע של תרבות התא כדי לעקר את הסרט מוכן לפחות 30 דקות. בינתיים, תעבדו מחדש את התאים המעובדים מראש ב-20 מיקרוליטרים של קרום מרתף. ואז פיפטה ההשעיה לתוך divots נוצר בסרט פרפין.
מניחים את חרוזים מוצקים סרט פרפין לתוך צלחת שש באר פיפטה שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום מחומם מראש המכיל 10 micromolar Y-27632 דיהידרוכלוריד לתוך כל באר תוך צחצוח בעדינות חרוזים את הסרט פרפין. כדי לעבד את האורגנואידים להיסטולוגיה, הסר את התקשורת הקיימת מה באר דואג לא לזמן את כיפות קרום המרתף. מוסיפים נפח שווה של פתרון שחזור תאים ו דגירה את הצלחת במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, לנתק את כיפת קרום המרתף באמצעות פיפטה ולמחוץ אותו עם קצה פיפטה. לאסוף את הכיפה דיסוציאציה ואת פתרון שחזור התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant ולהניח אותו בצד.
שמור את כל supernatants עד השלב הסופי כאשר נוכחות של organoids הוא אישר בנפח הרצוי של PBS קר בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לסלק מכנית את גלולה מבלי לשבש את האורגנואידים. חזור על הצנטריפוגה והסר את העל-טבעי. תקן את גלולה בנפח תואם של 4% PFA במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר קיבעון, חזור על שלב הצנטריפוגה ושטיפת PBS. ואז לאט להוסיף 200 microliters של חם 2% agarose ומיד אבל בעדינות לנתק את גלולת התא מקיר הצינור מבלי לשבש אותו באמצעות מחט מד 25 מחובר מזרק אחד מיליליטר. עבור שיטת ספין למטה agarose, זה קריטי כדי לנתק את גלולת התא מקיר הצינור מיד לאחר הוספת אגרוז באמצעות מחט מד 25.
לאחר שהתעוררות התגבשה לחלוטין, נתק אותה מהצינור עם מחט 25 מד המחוברת למזרק מיליליטר אחד והעבר אותו לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מלאו את הצינור ב-70%אתנול והמשיכו בפרוטוקול המקובל להתייבשות רקמות והטבעת פרפין. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי להקים אורגנואידים 3D מן המטופל נגזר xenograft מודלים של סרטן הערמונית גרורתי העצם, כמו גם ישירות מן הרקמה הסרטנית.
האורגנואידים הציגו פנוטיפים שונים שהתבטאו בציסטות, כדורידים ואיברים בעלי מורכבות גבוהה יותר. כיפה שלמה של קרום מרתף אורגנואידים ניתן לראות בתמונה תפורה מ 25 ברזולוציה גבוהה, תמונות הגדלה 10X. כדי להמשיך לחקור את רקמת הגידול, ציטוכימיה immunofluorescent בוצעה על קטע פרפין עבה חמישה מיקרומטר של אורגנואידים מיקוד סמן תא אפיתל בזלת cytokeratin-5, סמן תא אפיתל זוהר cytokeratin-8 ו DAPI.
פרוטוקול זה יכול להיות אופטימיזציה עבור יישומים אחרים כגון סופג מערבי, שיתוף תרבות ו cytometry זרימה כדי לחקור את המאפיינים של אורגנואידים 3D ואת ההשפעות של טיפולים תרופתיים. ניסויים אלה יכולים לטפל במנגנונים של עמידות לתרופות והיעילות של טיפולים חדשניים בלבד או בשילוב עם טיפולים נוכחיים. האורגנואידים תלת מימדיים מטכניקה זו שומרים על הטרוגניות בין-נושאית ואינטרה-נושאית ולכן הם מודל מדויק יותר של המחלה בחולים.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור מנגנונים של עמידות לתרופות, tumorigenesis, גרורות וטיפולים שעשויים להיות צפויים יותר של התקדמות המחלה בחולים ותגובתם לטיפול.
