פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים והדברת מחלות המועברות על ידי יתושים. שימוש בקווים דקים לבידוד וירוסים במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 הוא בטוח ויעיל יותר. שלא כמו הליכי בידוד וירוסים אחרים, כגון מחזור חיסון אדום עם נוזלים משתנים, טכניקה זו אינה מחייבת ניסויים בבעלי חיים או הערכה אתית.
הזיהום מהדגימות והתאים הנשאבים במהלך הדגירה יכול להוביל לכישלון הניסוי. לפיכך, יש צורך להוסיף 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin לתוך המדיום כדי למנוע זיהום. התחל עם תוספת של חרוזים קרמיים שלושה מ"מ, 1.5 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון בצינור סטרילי שני מיליליטר מונח על קרח ולאחר מכן להעביר 50 יתושים בו.
לאחר מכן, הומוגניזציה של יתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ו 4 מעלות צלזיוס במשך 3 מחזורים. צנטריפוגה הומוגנאט ב 15, 000 גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatants לצינורות החדשים. כדי להסיר את פסולת היתושים לחלוטין, צנטריפוגה את supernatant שוב ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
יש להכניס את 200 המיקרוליטרים של Supernatant P0 לצינור אחסון של פקק בורג של שני מיליליטר, ולאחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להגברת הנגיף, השתמשו בקו תאי יתוש חסר Aedes albopictus RNAi C6/36 וקו תאי חולייתנים, כליה של אוגר תינוק, או BHK-21 מבקבוק מרובע של 75 סנטימטרים וזרעו אותם ב-24 צלחות באר בנפרד. מניחים את צלחת 24 הזרעים היטב לילה ב 28 או 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר מפגש של 80% עד 90% בכל באר. הכינו 500 מיליליטר של מדיום תחזוקת תרבית התא בתוספת אנטיביוטיקה. מוציאים את מדיום תרבית התאים מ-24 צלחות הבאר ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית התאים לכל באר.
לאחר מכן לחסן את התאים עם 100 מיקרוליטר של supernatant של יתוש homogenate או P0. לדגור על הצלחות ב 28 או 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ולנער בעדינות את הצלחות לאחר כל 15 דקות כדי למנוע את התייבשות התאים. לאחר שתסיים, הסר את הסופרנאטנט ושטוף כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים כדי להסיר את הפסולת לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים לכל באר לפני שתניחו את הלוחות באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 28 או 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
מדי יום לפקח על מצב התאים של כל באר מתחת למיקרוסקופ. ביום השביעי, אספו את הסופרנאטנט של התאים המכונה P1 ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. חזור על התהליך כדי לאסוף סופרנאטנטים נגיפיים P2 ו- P3.
בשל ההשפעה הציטופתוגנית, או CPE, תאים מחלק מהבארות מתים ומתנתקים מפני השטח. כדי להגביר מאוד את הנגיפים, אספו 300 עד 400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מבארות המראות את אפקט ה-CPE והעבירו אותו לצלחת חדשה בעלת שש בארות בעלת מפגש תאים של 80% עד 90% תאי תרבית. לבסוף, אספו והעבירו 500 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מהבארות של צלחת שש הקידוחים לצינורות אחסון של פקק בורג שני מיליליטר לפני אחסונם במינוס 80 מעלות צלזיוס.
החיסון של תאי C6/36 עם יתוש homogenates P0 הציג חלל בין-תאי רחב בתאים exfoliated בתקופה של 120 שעות לאחר ההדבקה בהשוואה לתאים לא מחוסנים או ביקורת. דגירה של תאי BHK21 עם סופרנאטנטים נגיפיים P3 הדגימה CPE נראה לעין 48 שעות לאחר ההדבקה, והציגה את מות התא וניתוק מפני השטח בניגוד לתאי הביקורת. פריימרים אוניברסליים זמינים מסחרית או Flaviviruses, Alphaviruses ו Bunyaviruses שימשו כדי ליצור את מוצרי PCR עבור supernatant ויראלי.
מוצר PCR עבור וירוס Bunyavirus, וירוס אגם אבינור, הוגדר כבקרה חיובית. איסורי הגברת ה-PCR בנתיבים השייכים ל-Bunyaviruses והשליטה החיובית הדגישו את האפשרות של נוכחות Bunyavirus בסופרנאטנטים. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של בידוד הנגיף, יש לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך הובלת דגימות, בידוד וטחינה.
מוסיפים אנטיביוטיקה כאשר הומוגניזציה של היתושים והתרבות עצמה. ולטפל בתרבות במהירות במהלך הדגירה והסרת מדיום התרבות. בנוסף להליך זה, ניתן להזריק את תמיסת הטחינה לחולדה מחזורית או לעובר תרנגולת.
עם זאת, הליך האישור יעלה חששות אתיים ויגדיל את הוצאות הניסוי.
