从田间收集的蚊子中分离出蚊相关病毒

该方案是分离蚊子相关病毒的有用方法，可以帮助进一步研究与蚊子相关的病原体的分布和控制蚊媒疾病的控制。在生物安全2级实验室中使用细线分离病毒更安全，更有效。与其他病毒分离程序不同，例如用不同的液体循环接种红色，该技术不需要动物实验或伦理评估。

孵育过程中样品和细胞抽取的污染可能导致实验失败。因此，有必要在培养基中添加2%青霉素-链霉素-两性霉素以防止污染。首先在放置在冰上的两毫升无菌管中加入三毫米陶瓷珠，1.5毫升RPMI培养基补充2%青霉素 - 链霉素 - 两性霉素B溶液，然后在其中转移50只蚊子。

接下来，用低温组织均质器在 70 赫兹和 4 摄氏度下研磨 30 秒，使蚊子均质化 3 个周期。将匀浆在15， 000G下在4摄氏度下离心30分钟，并将上清液转移到新管中。为了完全去除蚊子碎片，在4摄氏度下再次以15， 000G离心上清液10分钟。

将200微升上清液P0等分到两毫升的螺帽储存管中，并将其储存在零下80摄氏度。对于病毒扩增，使用白纹伊蚊RNAi缺陷蚊细胞系C6 / 36和脊椎动物细胞系，小仓鼠肾或来自75厘米方形烧瓶的BHK-21，并分别将它们接种在24孔板中。将接种的 24 孔板在 28 或 37 摄氏度下过夜。

第二天，在显微镜下观察细胞，以确认每个孔中的80%至90%汇合度。准备500毫升补充有抗生素的细胞培养维持培养基。从24孔板中取出细胞培养基，并向每个孔中加入100微升细胞培养维持培养基。

然后用100微升蚊子匀浆或P0的上清液接种细胞。将板在28或37摄氏度下孵育60分钟，每15分钟轻轻摇动板以防止细胞干燥。完成后，除去上清液并用600微升细胞培养维持培养基冲洗每个孔，以完全去除碎片。接下来，向每个孔中加入800微升细胞培养维持培养基，然后将板置于28或37摄氏度的5%二氧化碳加湿培养箱中7天。

每天在显微镜下监测每个孔的细胞状态。在第七天，收集称为P1的细胞上清液并将其储存在零下80摄氏度。重复该过程以收集P2和P3病毒上清液。

由于细胞致病效应或CPE，来自某些孔的细胞死亡并从表面分离。为了极大地扩增病毒从显示CPE效应的孔中收集300至400微升上清液，并将其转移到具有80%至90%细胞汇合度的培养细胞的新六孔板中。最后，收集500微升上清液并将其从六孔板的孔转移到两毫升螺旋盖储存管中，然后将其储存在零下80摄氏度。

与未接种或对照细胞相比，用蚊子匀浆P0接种C6 / 36细胞在感染后120小时内在脱落细胞中表现出广泛的细胞间空间。BHK21细胞与P3病毒上清液孵育在感染后48小时显示出可见的CPE，与对照细胞相比，显示细胞死亡并从表面分离。市售通用引物或黄病毒、甲病毒和布尼亚病毒用于生成病毒上清液的PCR产物。

布尼亚病毒的PCR产物Ebinur Lake病毒被设定为阳性对照。属于布尼亚病毒的泳道中的PCR扩增禁令和阳性对照强调了上清液中存在布尼亚病毒的可能性。为了提高病毒分离的成功率，在样品运输、分离和研磨过程中保持低温。

在均质蚊子和培养物本身时添加抗生素。并在孵育和去除培养基期间快速处理培养物。除此程序外，还可以将研磨溶液注射到循环大鼠或鸡胚中。

然而，确认程序会引起伦理问题并增加实验费用。