עבודה זו נתמכה על ידי מענק מן העין לאומי (R01 EY12998) כדי FH אנדרדה.

1. הכנת Buffers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 5804R צנטריפוגות ולהגדיר עד 4 ° C. הפעל אמבט מים Isotemp להגדיר 3006D ו 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים לפני בידוד שרירים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS: ממיסים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) טבליות במים מזוקקים (5 טבליות / ליטר). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS פלוס 10 mM EDTA: כדי להכין פתרון 100 מ&quot;ל, להוסיף 2 מ&quot;ל של 500 mM EDTA עד 98 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ המיטוכונדריה 8X: 10.28 גרם של סוכרוז לריכוז סופי של 0.6 מ &#39;, 400 מ&quot;ג של חומצת שומן חופשית שור בסרום אלבומין (BSA) ריכוז סופי של 0.8%, 2.08 גרם של HEPES ריכוז סופי של 160 mM, pH עד 7.4 ו QS ל 50 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר בידוד 1 (IB1): הוסף 200 μl של 500 mM EDTA בריכוז סופי של 10 מ&quot;מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ&quot;מ, 1.25 מ&quot;ל של 8X pH המיטוכונדריה חיץ, כדי 7.4 ו QS עד 10 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר בידוד 2 (IB2): הוסף 60 μl של EGTA 500 מ&quot;מ ריכוז סופי של 3 מ&quot;מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ&quot;מ, 1.25 מ&quot;ל של 8X pH המיטוכונדריה חיץ, כדי 7.4 ו QS עד 10 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר ניסיוני (EB): הוסף 100 μl של 500 mM MgCl 2 בריכוז סופי של 5 מ&quot;מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ μl 2.5 KH 2 PO 4 בריכוז סופי של 6.25 מיקרומטר, 2 μl של 100 מ&quot;מ EGTA ריכוז סופי של 20 מיקרומטר, 1.25 מ&quot;ל של חיץ המיטוכונדריה, pH 7.4 ל ו QS ל 10 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </li></ul></li></ol> 2. בידוד שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך דלי קרח, להכניס שלוש כוסות 10 מ&quot;ל, פוטר, Elvehjem ומטחנות רקמות כל צורך במכשירים אחרים / אספקה ​​על הקרח. כל דבר חייב להישאר קר כקרח במשך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום IB1 ו IB2 בדלי קרח EB באמבט מים חמים בסיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלוש כוסות 10 מ&quot;ל, פתרונות הבא יש להוסיף: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Beaker 1: 10 מ&quot;ל של PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Beaker 2: 10 מ&quot;ל PBS / EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Beaker 3: 3 מ&quot;ל של IB1 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהרגו עכברוש אנושי כפי שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד במהירות 250-500 מ&quot;ג של שרירי השלד, לשטוף בכוס 1, ולאחר מכן להעביר Beaker 2. </li></ol> 3. Homogenization / בידוד מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שריר Beaker 3 דק לקצץ את השריר עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הפתרון homogenizer פוטר-Elvehjem. Homogenize השריר באמצעות העלי ממונע (מקדחה יעשה את העבודה) 10 פעמים לשמור את הצינורית קרח בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת homogenate מראש צונן צינורות microcentrifuge 2 מ&quot;ל ו - 700 גרם ב צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge. בטל גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב g 10,500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge ו SN1 תווית (מספר supernatant 1) וסוג השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה ב 500 μl של IB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 10,500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge ו SN2 תווית (מספר supernatant 2) וסוג השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות הסופי המיטוכונדריה גלולה ב 100 μl של IB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-ספין ההשעיה המיטוכונדריה הסופי minifuge במשך כמה שניות. אם יש גלולה, העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד 8. </li></ol> 4. אלקטרודה כיול הערה: כיול האלקטרודה השלם במהלך בידוד המיטוכונדריה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל מים מזוקקים כדי בקבוק 250 מ&quot;ל. מערבבים נמרצות במשך 20 דקות כדי לאזן את המים עם הגז האטמוספרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של 50% KCl אל האלקטרודה Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת נייר קטנה ה&quot;ריזלה כחול מתגלגל על ​​גבי האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת PTFE קרום על גבי הנייר מתגלגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הטבעת הפנימית באמצעות המוליך הטבעת ולאחר מכן למקם את הטבעת החיצונית של החריץ אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור אלקטרודות ולהרכיב את שאר הציוד: בסיס טבעת פלסטיק גדולה, חדר המיטוכונדריה, וצינורות מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תיבות Oxygraph ולהתחיל תוכנה Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המים equilibrated לתא המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ומערבבים בר להדליק למהירות של 60. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין ניסוי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כיול ולאחר מכן כיול שלב נוזלי תיבה 1. שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס ולחץ על &quot;אישור&quot; פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר &quot;עקיפת&quot; שינויים &quot;אישור&quot; לחץ עליו לפתוח את מיכל הדלק חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קצה מחוברלמיכל חנקן לתוך תא ולהקים חמצן אפס. לחץ על &quot;אישור&quot; כאשר הוא עובר מן &quot;עקיפת&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מים ולהוסיף 500 μl של חיץ EB לתאי המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם קאמרית עם הבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה משתמש תיבות מרובים, חזור על שלבים 11-15 עבור כיול של תיבה 2. </li></ol> 5. מיטוכונדריאלי נשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ניסוי חדש, לתת לו לרוץ במשך דקה 1 על מנת לייצב האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הנפח של ההשעיה המיטוכונדריה (שלב 3.11) עבור 150 מיקרוגרם בתא אחד, אירוע לציון, ולתת לו לרוץ במשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של חם 250 mM/125 mM גלוטמט / Malate ריכוז סופי של mM mM/2.5 5. מארק בוא לרוץ במשך דקה 1. זו מוגדרת כמדינה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 7.5 μl של 10 mM ADP ריכוז סופי של 150 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 30 שניות. זו מוגדרת כמדינה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 7.5 מ&quot;מ 10 ADP, לסמן, ולתת לרוץ 1.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.5 μl של oligomycin 10 קר mM ריכוז סופי של 1 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 3 דקות. זו מוגדרת כמדינה 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של קור 0.1 מ&quot;מ FCCP ריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 3 דקות. זו מוגדרת כמדינה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, בסוף הניסוי ולשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את שיעורי הנשימה באמצעות תוכנת Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן גורם נורמליזציה: אם הוספת 150 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה, הגורם נורמליזציה יהיה 0.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב שיעור הנשימה מנורמל עבור מדינות נשימה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחס בקרת הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מציגה נציג מעקב אחר צריכת החמצן של שריר השלד המיטוכונדריה. לאחר האות אלקטרודה הוא התייצב, המדגם המיטוכונדריה מתווסף חדר Oxygraph. מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט Malate. תוספת של ADP עולה צריכת החמצן, הגדרת 3 הנשימה המדינה. ה-ATP synthase חסומה על ידי תוספת של oligomycin להשיג 4 הנשימה המדינה. לבסוף, FCCP מתווסף לנתק הנשימה במיטוכונדריה (מצב 5). טבלה 1 מראה חמצן נציג שיעורי הצריכה של 2 מדינות, 3, 4 ו - 5. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) מחושב עבור כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ארצות </td><td> מנורמל חליפין </td></tr><tr><td> המדינה 2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td> מדינת 3 </td><td> 153.40 </td></tr><tr><td> המדינה 4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td> המדינה 5 </td><td> 143.70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. הנשימה שיעורי מיטוכונדריאלי. Representativeoxygen שיעורי הצריכה של שרירי השלד המיטוכונדריה. ערכים הם מנורמל לכמות של המיטוכונדריה הוסיף לחדר. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) נקבעת על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4. RCR ≥ 4 מהווה הכנה המיטוכונדריה קיימא.

<ol>
	<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease.">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, S96-S102 (2004).</li><li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease.">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia.">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li><li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria:+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function.">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד. אם התשואה היא בעיה, פרוטוקול ניתן לשנות על ידי דוגרים על שריר בודד 5 מ&quot;ל של טריפסין EDTA/0.01% PBS/10mM במשך 30 דקות בקרח. כדי להבטיח עיכול שרירים להשלים עם טריפסין, השריר צריך להיות טחון לגמרי. לאחר דגירה של 30 דקות, ה?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>95% CO2 / 5% O2 mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local gas company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine 5&#x2032;-diphosphate sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A2754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Rizla Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>890101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compressed nitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local gas company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9647</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E3889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0728</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Free fatty acid bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H7006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isotemp 3006D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Male Sprague Dawley Rats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harlan</td>
<td>300-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Malic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C1301P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oligomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygen electrode disc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>S1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygraph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygraph Plus V1.01 Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH-meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>1225506149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3911</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8416</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potter-Elvehjem homogenizers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-414-14A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTFE (0.0125mm &#215; 25mm) membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>S4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SKIL 3320 drill press</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hardware store</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5016</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mitochondrial isolation from skeletal muscle

המיטוכונדריה הם אברונים שליטה על החיים והמוות של התא. הם משתתפים תגובות מטבוליות מפתח, לסנתז ביותר של ה-ATP, ולהסדיר מספר איתות מפלי 2,3. חוקרים בעבר ובהווה יש לבודד מרקמות המיטוכונדריה חולדות ועכברים כגון מוח, כבד, לב 4,5. בשנים האחרונות, חוקרים רבים התמקדו לומד לתפקד המיטוכונדריה של שרירי השלד. כאן אנו מתארים שיטה השתמשנו בהצלחה הבידוד של המיטוכונדריה מן שרירי השלד 6. ההליך שלנו דורש שכל מאגרים ו ריאגנטים עשויים טריים צורך כ 250-500 מ&quot;ג של שרירי השלד. למדנו המיטוכונדריה מבודד הגסטרוקנמיוס חולדה ועכבר הסרעפת, ואת שרירי extraocular חולדה. ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי נמדדת עם assay ברדפורד. חשוב דגימות המיטוכונדריה להישמר קרים כקרח במהלך ההכנה כי מחקרים פונקציונלי להתבצע בתוך זמן קצר יחסית (~ 1 שעות). הנשימה מיטוכונדריאלי נמדד polarography עם אלקטרודה מסוג קלארק (מערכת Oxygraph) בשעה 37 ° C 7. כיול אלקטרודת חמצן הוא צעד מפתח פרוטוקול זה והיא חייבת להתבצע מדי יום. המיטוכונדריה מבודד (150 מיקרוגרם) מתווספים 0.5 מ&quot;ל של חיץ ניסיוני (EB). מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט (5mm) ו Malate (2.5 מ&quot;מ). ואז, diphosphate אדנוזין (ADP) (150 מיקרומטר) מתווסף להתחיל המדינה 3. Oligomycin (1 מיקרומטר), חוסם synthase ATPase, משמש אומדן המדינה 4. לבסוף, קרבוניל ציאניד p-[trifluoromethoxy]-פניל-hydrazone (FCCP, 0.2 מיקרומטר) מתווסף measurestate 5, או זוגיים הנשימה 6. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR), היחס של המדינה 3 למצב 4, מחושב לאחר כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא. לסיכום, אנו מציגים שיטה הבידוד של המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד כי ניתן להשתמש ביוכימית (למשל, פעילות האנזים, immunodetection, proteomics) מחקרים תפקודית (נשימה המיטוכונדריה).

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle at JoVE.com

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ Scorrano<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). ההליך בידוד המיטוכונדריה דורשת כ 2 שעות. הנשימה המיטוכונדריאלי ניתן להשלים תוך שעה בערך 1.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

28.8K Views.  University of Kentucky. פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ Scorrano Et al. (2007). ההליך בידוד המיטוכונדריה דורשת כ 2 שעות. הנשימה המיטוכונדריאלי ניתן להשלים תוך שעה בערך 1.

Video: Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.