העור מכיל סוגי תאים מרובים כולל, קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן עצביים. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו לניסויים במבחנה. בידוד והקמת תרביות תאים ראשוניות בודדות מתורם יחיד מאפשרת השוואות חזקות וניסויים בתרבית משותפת, תוך צמצום ההשפעות של שונות גנטית.
עם פרוטוקול זה, ניתוח של תאים בודדים ואת האינטראקציות שלהם מאפשר את הניתוח של התפקיד של תאי שוואן בהומאוסטזיס של העור ובפתופיזיולוגיה. אוכלוסיות תאים מובחנות אלה יכולות לשמש לחקר תאי שוואן, פיברובלסטים או קרטינוציטים בנפרד או בשילוב בפיזיולוגיה של העור, ריפוי פצעים או במצבים של מחלות עור. Jagadeeshaprasad M G, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי יסייע לי להדגים את ההליך.
לאחר רכישת העורלה היילודית בעקבות נהלי הטיפול הסטנדרטיים, מניחים את העורלה הנכריתה בצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל שמונה עד 10 מיליליטרים של מדיום בסיסי DMEM קר כקרח, ומעבירים מיד את העורלה למעבדת תרביות התאים לבידוד תאים. יש לשטוף את העורלה פעמיים עם 20 עד 25 מיליליטרים של Dulbecco's Phosphate Buffered Saline או DPBS, המכילים אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטית. לאחר מכן השרו את העור השטופ ב-25 עד 30 מיליליטרים של מדיום בסיסי DMEM קר כקרח בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ.
לאחר 15 דקות פורסים את העורלה הפתוחה באמצעות אזמל כדי לחשוף את הדרמיס ואת רקמת השומן התת עורית. השתמש במלקחיים, להב אזמל ומספריים כדי להסיר ולהשליך את רקמת השומן התת עורית. לאחר מכן חותכים את העורלה הנקייה לשלוש עד חמש חתיכות קטנות יותר ומדגרים את חתיכות העור ב-16 עד 20 מיליליטרים של דיספייס מדיום DMEM אחד בצינור חרוטי סטרילי.
במהלך 30 הדקות הראשונות של הדגירה עם Dispace מערבבים לסירוגין את פיסות העור בצינור החרוטי על ידי היפוך. לאחר מכן מניחים את הצינור החרוטי בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. למחרת מסירים את פיסות העור ומניחים אותן על צלחת תרבית סטרילית יבשה ופותחים כל פיסת עור כך ששכבת האפידרמיס החיצונית נוגעת בצלחת התרבית.
החל מקצה הרקמה מקלפים את האפידרמיס מהדרמיס באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים. הוסיפו את שברי האפידרמיס המופרדים לחמישה מיליליטרים של HBS בצלחת תרבית של 10 ס"מ כדי לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן לאסוף את תמיסת HBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף חמישה מיליליטרים של חיץ נטרול טריפסין או T ו- B בצינור החרוטי.
הניחו את הצינור בצד. לקטעי האפידרמיס בצלחת התרבית מוסיפים שלושה מיליליטרים של תמיסת טריפסין כדי לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה מתסיסים בעדינות את שברי האפידרמיס עם מלקחיים עד שתמיסת הטריפסין קרטינוציטים הופכת עכורה.
לאחר מכן הוסף את תמיסת הקרטינוציטים של טריפסין לצינור HBS T ו- B. לאחר המסת שברי אפידרמיסה לא מעוכלים עם תמיסת טריפסין EDTA, הוסיפו שני מיליליטרים של FBS לצינור HBS T ו-B המכיל תמיסת טריפסין EDTA, וצנטריפוגה של השניים בערך 870 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והחזירו את כדור התא בשלושה מיליליטרים של מדיום גדילה מלא של קרטינוציטים, ולאחר מכן סינון של תרחיף התא עם מסנן סטרילי של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.
לאחר כימות מספר התאים וכדאיות התאים, זרעו את התאים בלוחות התרבית כדי להניחם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני. לאחר יומיים שואפים לתאים שאינם דבקים, ומרעננים את המדיה של תרביות התאים מדי יום ביומיים עד שהקרטינוציטים מגיעים ל-50%-80% מפגש לניסויים חולפים או במורד הזרם. צלוחיות T25 Precoat עם פולי-l-ליזין או PLL, תוך שימוש בחמישה מיליליטרים של DPBS ומניחות את הצלוחיות המוכנות מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.
מאוחר יותר לשטוף את מטריצת ציפוי PLL פעמיים עם DPBS. לאחר שטיפת החלקים המבודדים של הדרמיס עם חמישה מיליליטרים של מדיום בסיסי DMEM, טחנו את הדרמיס לחתיכות קטנות עם מספריים. מעכלים את הדרמיס הטחון עם חמישה מיליליטרים של קולגן ב-37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים וחצי, עם טיטרציה עדינה באמצעות קצה פיפטה כל 30 דקות עד שהדרמיס מתנתק לחלוטין.
לאחר העיכול, מסננים את תרחיף התא עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר, ולאחר מכן דילול של תרחיף התא המסונן עם חמישה מיליליטרים של מדיום DMEM שלם כדי לעצור את הפעילות האנזימטית של קולגןאז. לאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה של התא ב-870 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והחזרת פתק ההצבעה של התא בשני מיליליטרים של מדיום מלא של DMEM כדי לחלק את התאים. לאחר חזרה על תהליך הצנטרפיקציה כמתואר, שאפו לסופרנטנט להשתמש בכדור התא כדי לבודד את תאי שוואן או את הפיברובלסטים.
כדי לבודד את תאי שוואן, יש לבצע החייאה של כדורי התא בחמישה מיליליטרים של מדיום DMEM מלא טרי ולכמת את מספר התא ואת יכולת הקיום לפני זריעת חמישה מיליליטרים של התאים המוחזרים בצלוחיות T25 מקודדות מראש בצפיפות של פי 4.0 10 לשלושת התאים למיליליטר. הדגירה של הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר 16 שעות לאשר הידבקות תאים על ידי מיקרוסקופיה בהגדלה של פי 10.
לאחר מכן הסר את התאים שאינם דבקים ושטוף את הבקבוקון שלוש פעמים עם חמישה מיליליטרים של DPBS. לאחר מכן הדגירה של התאים עם חמישה מיליליטרים של 10 מיקרומולר ציטוזין ארבינוזיד במדיום שלם של DMEM. לאחר 24 שעות לשאוף את הציטוזין ארבינוזיד המכיל מדיום לפני שטיפת הבקבוקון כפי שהוכח קודם לכן.
מלאו מחדש את בקבוק התרבית בחמישה מיליליטרים של תאי שוואן שלמים את מדיום התרבית כדי לדגור 48 שעות, תוך רענון המדיום כל יומיים עד שתאי שוואן מגיעים ל-80% מפגש. כדי לבודד את הפיברובלסטים, יש להחיות את הכדור שנאסף בחמישה מיליליטרים של פיברובלסטים במדיום שלם. כדי לתרבת את התאים בבקבוקי תרבית T25 שאינם מקודדים במשך 24 שעות כפי שהודגם עבור תאי שוואן.
לאחר שאיפת התאים שאינם דבקים ושטיפת הבקבוקון, דגירו את התאים עם חמישה מיליליטרים של פיברובלסטים טריים בעלי מדיום מלא ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך 48 שעות. מכיוון שהתאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה לתרבית תאים, הקרטינוציטים הראשוניים הגיעו ל-85% מפגש ביום השביעי והפגינו מורפולוגיה אופיינית של תאים עם צורת אבן מרוצפת. תאי שוואן הגיעו ל-95% מפגש ביום החמישי ונראו דו קוטביים או בצורת טריפולאר.
תרביות הפיברובלסטים הגיעו למפגש של 95% ביום הרביעי ורוב התאים הציגו מורפולוגיה של צורת ציר. הכתם האימונופלואורסצנטי אישר את ביטוי החלבון הספציפי של סוג התא בתרביות התאים. הקרטינוציטים היו חיוביים לחלבון K10 ו-K14.
התמונות הממוזגות של אימונופלואורסצנציה של קרטין וכתמים גרעיניים של DAPI הצביעו על טוהר של 97.8% מתרביות התאים. באופן דומה, תאי שוואן היו חיוביים ל-S100 ול-P75 NTR והיה להם טוהר של 95.2% בתרבית. הפיברובלסטים ביטאו באופן חיובי את הווימנטין, אך לא ביטאו את השריר החלק אלפא אקטין, סמן מיופיברובלסט.
טוהר התרבית היה סביב 97.2% כדי להעצים את הראיות של שאנסה, ניתן להשתמש במנה פולי-ל-ליזין מצופה מראש. וכדי למתן עוד יותר את הזיהום הסיבי, נוספו ציטוזין ארבינוזיד וחומר אנטי-מיקוטי לאחר שהתאים הוסיפו לזמן קצר. זהו הליך ניסיוני פשוט וזול כדי לבסס את שלושת התאים העיקריים, כגון תאי שוואן, קרטינוציטים ופיברובלסטים, מעור קדמי אנושי יחיד.
פרוטוקול זה אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת תאית או הצלבה בין סוגי תאים.
