פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשיג מספר רב של חיישן ואת פיברובלסט המנוע ותאי שוואן במהירות. התאים המתקבלים באמצעות הודעה זו יכולים לשמש בחקר התחדשות העצבים ומחלות מערכת העצבים. אנו מראים שהדגמה יכולה לייצג את הניסוי כדי לשלוט טוב יותר בזמן של צעד עיכול דיפרנציאלי ולהפוך את הצעדים הניסיוניים לקלים יותר להבנה.
כדי להתפוצץ להשתמש במספריים כדי לבצע חתך של שלושה סנטימטרים, בעור הגב. הסר את עמוד השדרה. פתח בזהירות את תעלת החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה.
תחרה חוט השדרה בצלחת פטרי 60 מילימטר, עם שלושה עד ארבעה מיליליטר של קר קרח D הנקס פתרון מלח מאוזן תחת מיקרוסקופ ניתוח, בלו שורש הגחון ואת השורש הגבי. מניחים אותם בתווית מלח מאוזנת D קר כקרח. לאחר הסרת HBSS, לחתוך את העצבים לחתיכות שלושה עד חמישה מילימטר, עם מספריים.
מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ומעבירים את חתיכות העצבים לחמישה צינורות צנטריפוגה מיליליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 20 דקות. לאחר מכן, כדי לעצור את העיכול, להוסיף ב 3-4 מיליליטר של DMEM המכיל 10% נסיוב חזיר עוברי.
פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות על 10 פעמים. צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה להשליך את העל טבעי.
ולהשעות מחדש את המשקעים בשניים עד שלושה מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן רשת 400, ולאחר מכן להשתמש ההשעיה כדי לחסן צלחת פטרי 60 מילימטר. דגירה מנות פטרי במשך ארבעה עד חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% פחמן דו חמצני.
כאשר התרבות הגיעה 90%confluence, לשטוף את התאים פעם אחת באמצעות 1XPBS. לאחר מכן, כדי לעכל את התאים שוואן, להוסיף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס לכל צלחת 60 מילימטר. לאחר 8 עד 10 שניות בטמפרטורת החדר, לעצור את העיכול, על ידי הוספת שלושה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS.
כדי לנתק את התאים שוואן, בעדינות לפוצץ על התא עם פיפטה. ודא לפי מיקרוסקופ שהתאים מנותקים. לאחר מכן לאסוף את המדיום, אשר מכיל את תאי הברבור, צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי, והשהה מחדש את המשקעים בשלושה מיליליטר של מדיום. השתמשו בהשעיה זו כדי לחסן מנות פטרי לא צותתות באורך 60 מ"מ, ולהדרגר את הכלים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות. מותגים למדיום, שיכיל את תאי שוואן לצלחת בינונית מצופה פולי L ליסין, וידגירה של המנה ב-37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
לאחר הסרת המדיום המכיל את תאי שוואן לשטוף את fibroblasts, דבק צלחות פטרי עם 1XPBS. כדי לעכל את הפיברובלסטים, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול כדי להמשיך במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לסיים את העיכול על ידי הוספת DMEM בתוספת 10%FBS.
כדי לנתק את fibroblasts, להשתמש פיפטה לפוצץ על החלק התחתון של המנה. לאסוף את המדיום, כולל fibroblasts, ולהעביר אותו צינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה הצינורות ב 800 פעמים G במשך חמש דקות.
השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על המשקעים עם שני מיליליטר של DMEM המכילים 10%FBS. לחסן את התאים לא מקודד, 60 מילימטר, צלחות פטרי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 45 דקות. לבודד את fibroblasts אשר ידבק צלחות פטרי, על ידי הסרת והשליכת מדיום הצמיחה.
הוסף שלושה מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד המעבר תא אחד להגיע 90% confluence. חזור על העיכול והדבקות דיפרנציאליים.
לאחר culturing המעבר fibroblasts ותאי שוואן במשך יומיים, לעכל את התאים, לאסוף אותם, לספור אותם. לחסן שקופיות מצופות PLL בריכוז של אחד פעמים 10 של תאים אלה לגם עבור כתמים ICC. מיקרוסקופי הניגוד של ביי מראה את המורפולוגיה של תאי שוואן מתורבתים ופיברובלסטים לאורך כל תהליך הבידוד.
לאחר זמן תרבות ממושך, התאים Schwann היו מקובצים יחד בין fibroblasts או ממוקם על פני השטח של fibroblasts. לאחר עיכול במשך 10 שניות, התאים Schwann, מסומן על ידי החצים האדומים, היו עגולים בעוד fibroblasts נשארו שטוחים היו מחוברים לתחתית המנה. לאחר הבידוד על ידי עיכול דיפרנציאלי והדבקות דיפרנציאלית נצפו מורולוגיות תאים אופייניות לכל ארבעת סוגי התאים.
פיברובלסטים מוטוריים, פיברובלסטים חושיים, תאי שוואן מוטוריים ותאי שוואן חושיים. הפיברובלסטים החושיים והמנועיים הודמיו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר של מוקד חרוט. הפיברובלסטים היו מוכתמים בנוגדנים נגד צבע CD 90 X33342 ששימש לתיוג גרעיני התא.
התמונות הממוזגות של חיסון פיברובלסטים וכתמים גרעיניים, הצביעו על כך ש-92.51% ו-92.64% מהתקליטור 90 ותאים עם תוויות משושה היו קיימים במנוע ובפיברובלסטים חושיים בהתאמה. תאי שוואן החושיים והמנועים הודמיו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. התאים Schwann היו מוכתמים בנוגדנים נגד S100 X33342 צבע שימש כדי לתייג את גרעיני התא.
תמונות המיזוג של כשל חיסוני של תאי ברבור וכתמים גרעיניים הצביעו על נוכחותם של 91.61% ו-93.56% מ-S100 ותאים משועקעים עם תוויות במשותף בתאי שוואן מוטוריים ו החושיים, בהתאמה. טוהר התא נותח גם באמצעות ציטומטריית זרימה. בתרבות פיברובלסט, כ -90% מהתאים היו פיברובלסטים, שצוין על ידי M2 בגרפי FCA בעוד התאים הנותרים היו תאים שוואנים.
בתרבויות התאים של שוואן, יותר מ-92% מהתאים היו תאי שוואן, שוב הצביעו על ידי M2 בגרפי FCA, בעוד התאים הנותרים היו פיברובלסטים. פרוטוקול זה שימושי לעתים רחוקות להתחלת המנגנון של התחדשות עצבים חיישנים ומוטוריים של פיברובלסטים, והשתלת תאי שוואן, כדי לקדם התחדשות עצבית.
