המחבר מבקש להודות אנט Blak רסמוסן, קריסטין מולר התמיכה הטכנית שלהם

האוסף של דגימות עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוח פלסטי מחייב אישור מן הוועדה האתית במוסדות המארח. פרוטוקול זה אושרה על ידי אזורי אתית הוועדה של אזור Midtjylland, דנמרק (M-20110027). השיטה המתוארת כאן נגזר ממחקרים דומים על ידי. Maciaq et al. 10 ו ליו, Karasek11.
1. בידוד של Keratinocytes מהעור האנושי
<ol>
	<li>נתחיל בכך את הפתרונות הבאים: 50 מ ל תמיסת גלוקוז טריפסין, 0.1% 0.25% ב- DPBS. מיקס ומסנן לחטא (0.2 µm) הפתרון. הכינו 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS פתרון, 50 מ של DPBS ותקין ללא סרום בינוני (KSFM). להוסיף 500 מ"ל של KSFM KSFM תוספי תזונה ו- 250 µL של gentamycin. לחמם את הפתרונות 37 ° C לפני השימוש.</li>
	<li>לאסוף עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוחים פלסטיים. הדגימות העור בשימוש כ 10 ס"מ x 15 ס מ, אך יכול להשתנות בגודלו. שמור הקריר העור תחת תחבורה על ידי הובלת את העור הדגימות בקופסת קלקר המכילה קירור. במידת הצורך, דוגמית העור ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להסיר שומן מן תחת המקטע העור באמצעות מספריים מעוקר, כמו מה, אזמל, מלקחיים.</li>
	<li>אבזם את המקטע העור (כ 10 ס"מ על 15 ס"מ) על כיסוי סטרילי על גבי צלחת באמצעות מחטים. ראשית, לנקות את העור עם כרית יבשה גאזה מעוקר. לאחר מכן לנקות את העור באמצעות כרית סטיריליים גזה עם 70% אתנול.</li>
	<li>באמצעות פלנר רגל, חתך של השכבה העליונה (האפידרמיס) של המקטע העור ושם אותו בתוך 9 ס מ פטרי. לאחר מכן, מיד להוסיף 25 מ של הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז (להכין בשלב 1.1) צלחת פטרי. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באמצעות פיפטה להסיר את הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז הפטרי ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS כדי להשבית את טריפסין.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים שני, עכשיו שחרר את התאים באפידרמיס לתוך האמצעי על ידי גירוד ובעדינות לזעזע את אפידרמיס והן תא עורי של הסעיפים העור.</li>
	<li>לסנן את המתלים תאים באפידרמיס דרך פילטר מתכת (גודל החור של 1 מ מ), ולאסוף בשפופרת 50 מ. להוסיף הסעיפים הנותרים העור שפופרת 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של RPMI-1640 ללא FBS ו מערבולת למסנן ס' 10 ההשעיה דרך המתכת לסנן לתוך צינור 50 מ ל המכיל את המתלים תאים באפידרמיס. להוסיף DPBS הנפח הכולל של 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תאים באפידרמיס כ- 10 מ"ל של 37 ° C KSFM בהתאם לגודל בגדר התא. לספור את התאים באמצעות התכלת Trypan מכתים שיטת תחת מיקרוסקופ. מספר התאים המתקבל מקטע העור 10 ס"מ על 15 ס"מ הוא כ 50-100 x 106 תאים. את כל הבקבוק תרבות2 75 ס מ, העברת תאים6 8 x 10 יחד עם 12 מ של 37 ° C KSFM. ללחוץ בעדינות את המבחנות תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של תאי.</li>
	<li>דגירה של keratinocytes ב חממה 37 ° C עם 100% לחות ו-5% CO2. לשנות את המדיום ואחרי יומיים שלוש פעמים בשבוע. מעבר תאים כאשר 70-80% confluent, אשר לוקח כשבועיים תלוי קצב התפשטות keratinocytes התרבות.</li>
</ol>
2. passaging של Keratinocytes
<ol>
	<li>מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 4.5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות 75 ס מ2 .</li>
	<li>הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 4.5 מ ל/75 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.</li>
	<li>כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוק תרבות נגד היד כדי לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 6 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס)2 . הבקבוק תרבות 75 ס מ, להעביר התליה תא צינורות 50 מ.</li>
	<li>לשטוף את המבחנות תרבות עם 3 מ"ל של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. צנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>Resuspend תאי pelleted 10 מ"ל של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לספור את התאים ולהעביר 3 x 106 תאים בקבוקון תרבות 150 ס"מ2 יחד עם 20 מ של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לנער בעדינות את הבקבוק תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים. להקפיא את התאים כאשר התרבות היא 80-90% confluent, אשר לוקח כ 4-6 ימים בהתאם קצב התפשטות keratinocytes (ראה סעיף 3, הקפאת פרוטוקול להלן). הרחב את keratinocytes ליצירת מניות קפוא המתאים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. הקפאת Keratinocytes
<ol>
	<li>מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 9 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות2 150 ס"מ.</li>
	<li>הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 9 מ ל/150 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.</li>
	<li>כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוקון תרבות נגד היד על מנת לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 12 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס) הבקבוקון תרבות של2 ס מ 150, תשאף התליה תא ל 50 מ ל צינורות.</li>
	<li>לשטוף את המבחנות תרבות עם 6 מ של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. Centrifuge צינורות 10 דקות ב g x 450-4 מעלות צלזיוס. הכן תא קר כקרח קפוא בינוני (KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>Resuspend בגדר תא KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד לספור את התאים, הקפאת תאים על צפיפות של 6 x 106 תאים למ"ל באמצעות שיטות הקפאה קריוגנית קירור איטי תקן12.</li>
	<li>לאחסן את keratinocytes בחנקן נוזלי (אדי שלב) עד מוכן לשימוש.</li>
</ol>
4. מפשיר ו Culturing Keratinocytes קפוא
<ol>
	<li>במהירות להפשיר את הבקבוקונים קפוא המתאים באמבט מים 37 ° C. השתמש 70% אתנול לנקות את החלק החיצוני של cryovial. להעביר מספר מתאים של תאים (כ- 15,000 תאים/cm2) בקבוקון תרבות ולהוסיף מיד מדיום הגידול ומחוממת מראש (KSFM) הבקבוקון תרבות. ניתן להשתמש בכל גודל של תרבות מבחנות בהתאם הכיוונון של הניסוי.</li>
	<li>השתמש בינוני תרבות 5 מ"ל בקבוקון תרבות2 25 ס מ.</li></ol>מספר התאים הוסיף שהבקבוקון תרבות עשויות להשתנות כי הצמיחה של התאים משתנה התורם תורם. דגירה בתאים 37 ° C חממה עם 100% לחות ו-5% CO2.
	<li>שינוי המדיום לאחר יומיים, שלוש פעמים מדי שבוע באמצעות KSFM מראש ומחוממת טריים. הערה: הנתונים שלנו הראו כי בממוצע 95% של תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול המתוארים כאן הם חיוביים עבור cytokeratine-14 תקין-מרקר13.</li>

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes:+key+immunocytes+of+the+integument.">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions.">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li><li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases.">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li><li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation.">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li><li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+(MMP-1)+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes.">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li><li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes.">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li><li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth:+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes.">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li><li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture.">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin.">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2008).</li><li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent.">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li><li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

. המחבר יש אין ניגוד אינטרסים.

כאן, אנו נתאר כיצד לבודד בקלות keratinocytes האדם העיקרי מן העור למבוגרים, וכיצד תרבות אותם במבחנה. מודל זה יכול להיות יישום נרחב לחקירה של ביולוגיה של התא עוריות ולאחר יכול להיות שימושי עבור מהחוקרים המעוניינים ללמוד מחלות עורית.
חלק מהיתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הוא בנ?...

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף האדם ומשמש מחסום מגן מפני הסביבה החיצונית. העור מורכב שתי שכבות עיקריות: דרמיס לאפידרמיס, איפה האפידרמיס מהווה את השכבה החיצונית ביותר של העור. הסוג הנפוץ ביותר תאי האפידרמיס הוא keratinocytes הכוללת יותר מ 95% של מסה1,תא2. Keratinocytes נשמרים בשלבים שונים של בידול האפידרמיס, מאורגנים לשכבות הבזליים, spinous, פרטנית ו cornified התואמים בשלבים מסוימים של בידול3. התפקיד העיקרי של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך לייצר מחסום שלם לעולם החיצון.
Keratinocytes לייצג גם את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בעור, לכן יש תפקיד חשוב ב4,תגובה חיסונית מולדת5. חשיפת keratinocytes לגירויים חיצוניים מוביל ההפעלה של איתות המסלולים תאיים ובעקבות כך, ייצור של מספר מתווכים דלקתיים שונים, לרבות ציטוקינים, נוגדנים פפטידים מיקרוביאלית. חלבונים אלה נגזר תקין להשתתף בתגובה דלקתית על ידי גיוס והפעלת תאים חיסוניים כגון תאים דנדריטים, נויטרופילים ספציפי T תאים6,7. לכן, בגלל keratinocytes לשחק תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים רבים, הרציונל מאחורי הטכניקה המובאת כאן היה ליצור מודל במבחנה ללמוד ביולוגיה העור. תרבויות תקין ראשוני המתקבל העורלה neonatal משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד העור-ביולוגיה-8,-9. עם זאת, עם הטכניקה המתוארת כאן, keratinocytes של שני המינים מתקבלים וכתוצאה מכך מגוון ביולוגי גבוה יותר של התאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על בידוד ועל הדור של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, כולל תחזוקה, הקפאה של keratinocytes. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר ראשי keratinocytes אנושי שיכול לשמש כמודל ללמוד ביולוגיה עורית חוץ גופית בתוך.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>KSFM supplements</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Supplements for KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimethyl sulfoxid</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Cell culture medium additive</td></tr><tr><td>Sterilization filter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Syringe filter with a pore size of 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Used to trypsinize cells</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>-</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Used to inactivate trypsin</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>-</td><td>-</td><td>Forceps from any company can be used</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>-</td><td>-</td><td>Scissors from any company can be used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Scalpels from any company can be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gauze pads</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Gauze pads from any provider can be used</td></tr><tr><td>Foot planer</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Foot planer from any provider can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Petri dishes from any provider can be used</td></tr><tr><td>Metal filter</td><td>-</td><td>-</td><td>In-house 1 mm hole size metal filter</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>NUNC</td><td>156499</td><td>-</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>TTP</td><td>90151</td><td>-</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Used to trypsinize cells when passaging</td></tr></tbody></table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

הפונקציה העיקרית של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך שומר על מחסום מכני אל העולם החיצון. בנוסף, keratinocytes ממלאות תפקיד חיוני החניכה, תחזוקה, רגולציה של תגובות חיסוניות עוריות באופן אקטיבי של מערכת החיסון המולדת להגיב לגירויים antigenic בצורה מהירה, לא ספציפית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור בידוד של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, ומדגימים כי תאים אלה מגיבים סידן-induced התמיינות סופנית, כפי שנמדדה על ידי ביטוי מוגבר של involucrin סמן בידול. בנוסף, אנו מראים כי keratinocytes מבודדים הם מגיבים IL-1β-induced הפעלת איתות המסלולים תאיים כפי שנמדד על-ידי הפעלת מסלול MAPK p38. יחדיו, נתאר שיטת בידוד, culturing של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. מאחר keratinocytes הן סוג התא השולט האפידרמיס, שיטה זו שימושית לחקור את המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית בתוך חוץ גופית.

סידן-induced התמיינות סופנית Keratinocytes האדם עוברים התמיינות סופנית בעת טיפול עם סידן14,15,16. ראשי keratinocytes האנושי היו מבודדים ותרבותית כמפורט בפרוטוקול לעיל. כאשר כ 50-60% confluent, התאים היו מגורה עם סידן (1.2 מ מ) או הרכב ותמונות של התאים צולמו ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin at JoVE.com

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.3K Views.  Aarhus University Hospital. העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

Video: Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biology

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Bioengineering

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

יצירת תרביות ראשוניות להדמיית תאים חיים של קרטינוציטים

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neuroscience

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

בידוד קרטינוציטים בעור האדם: שיטה לתרבית קרטינוציטים ראשוניים מדגימות עור

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...