פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לדגום את שכבות המשנה של קרום הצפק מביצי העופות להמשך חקירה של תפקידם הפיזיולוגי ברביית ציפורים. הדגימה של קרום perivitelline כבר אופטימיזציה בכל שלב כדי להגביל את כל נזקים מבניים ומולקולריים. הפרוטוקול פותח עוד יותר עבור פרוטאומיקה מעמיקה.
התחל על ידי דגימת שכבת perivitelline או PL מן הביצה הטרייה לא מופרית. שוברים את הביצה ומשתמשים במפריד ביצים כדי להפריד את החלמון מהלבן. הסר את chalazae עם מספריים קטנים לגלגל את החלמון על נייר מסנן כדי להסיר אלבומין חסידים המופיע כמבנה שקוף אך גלוי.
לטבול את החלמון גבישי המכיל 10 מילימולר Tris HCL ב pH שמונה כי כבר מקורר בעבר ארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את אזור PL מעל הדיסק הנביטה בתוך אזור סנטימטר אחד באמצעות מספריים קהה. קרע את PL עם מספריים קטנים בתוך החיץ, ולאחר מכן להחזיק את שני הקצוות של PL קרוע עם מלקחיים לקלף אותו החלמון. לשטוף את PL מספר פעמים באמבטיות של 10 מילימולאר Tris HCL עד אין עקבות של חלמון גלוי.
ודא שה- PL נקי, לבן וצף במאגר. לעבד את PL עבור הפרדת שכבת משנה או להמשיך ישירות ניתוחים ביוכימיים. כדי להפריד את OPL ו- IPL, להפיץ את המדגם כולו עם OPL פונה כלפי מעלה בצלחת פטרי פלסטיק מלא 10 מילימולאר טריס HCL ו 50 מילימולאר נתרן כלורי ולשמור אותו שטוח עם כמה שפחות קמטים.
קבע את המיקום של הצ'לאז הנותר המצורף רק ל- OPL. ואז לחתוך את כל PL לחתיכות של כשני על שלושה סנטימטרים עם מספריים קטנים. מפרידים מכנית בין שתי השכבות בעזרת מלקחיים מדויקים במיוחד תחת מיקרוסקופ מנתח.
לאחסן את דגימות IPL ו OPL וכתוצאה מכך בנפרד בצינורות מיקרו ב שלילי 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. כדי לבצע solubilization חלבון ראשוני, להקפיא לייבש את דגימות IPL ו OPL בנפרד כדי להסיר את המים הנותרים, ולאחר מכן לחתוך כמיליגרם אחד מכל מדגם ומניחים אותו בתוך צינור מיקרו נקי עם מכסה בורג חסין דליפה. שמור את הדגימות הנותרות בצינורות סגורים היטב לאחסון ממושך ב 20 שלילי או שלילי 80 מעלות צלזיוס.
מערבבים מיליגרם אחד של כל שכבת משנה ליאופילית עם 400 מיקרוליטרים של 50 מילימולאר טריס ב- pH 7 ו 500 נתרן כלורי מילימולארי. השתמש טחנת מערבל פעמיים במשך חמש דקות ב 30 הרץ כדי לפורר את המבנים לתוך חלקיקי מיקרו להקל על solubilization חלבון. לאסוף 400 microliters של הדגימות לתוך שני צינורות מיקרו נקיים.
כדי להכין את הדגימות לאלקטרופורזה, הוסף מאגר מדגם 5X SDS-PAGE לכל דגימת 400 מיקרוליטר וחמם אותו ל-100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לטעון מקסימום של 20 מיקרוגרם של חלבונים לתוך כל נתיב של 4-20% שיפוע SDS פוליאקרילמיד ג'ל ולבצע אלקטרופורזה ב 120 וולט. לאחר אלקטרופורזה, להסיר את הג'ל מצלחות הזכוכית ולהכתים אותו עם פתרון כחול מבריק Coomassie במשך 30 דקות, ולאחר מכן דה כתם עם פתרון המורכב 50% מים, 40% אתנול ו 10% חומצה אצטית עד רקע הג'ל מופיע כחול בהיר.
מעבירים את הג'ל לתבשיל פטרי המכיל מים שעברו דה-צביעה והידרציה מחדש. חלבונים צריכים להופיע כמו להקות כחולות עם רקע שקוף. ה- PL היה נתון למאגרים שונים כדי לזהות תנאים המאפשרים אובדן חלבון מינימלי והפרדת שכבת משנה אופטימלית.
חלבון המשתחרר בריכוזים משתנים של Tris, pH ונתרן כלורי מוצג כאן. שתי שכבות המשנה שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופ מנתח. IPL הוא שקוף בעוד OPL הוא צפוף, מעונן, לבנבן.
לאחר ההפרדה, OPL ו- IPL היו lyophilized באופן עצמאי ותכולת החלבון שלהם היה מומס לחלוטין באמצעות שילוב של שחיקה מכנית, דטרגנט אניוני, סוכן הפחתת, רותחים. הדגימות הציגו פרופילים אלקטרופורטיים מובהקים על ג'ל פוליאקרילאמיד. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי הפרדת שכבות המשנה היא שלב קריטי של ההליך ויש לבצע באמצעות מיקרוסקופ משקפת במאגר המכיל ריכוז מינימלי של מלח.
כדי להבהיר עוד יותר את תפקודם הפיזיולוגי בהתאמה, ניתן לנתח את דגימות שכבת המשנה של קרום perivitelline עבור אפיון היסטולוגי באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית ולמחקרים פונקציונליים באמצעות מבחני הדמיה והעברת תאים.
