עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי כספים הניתנים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בשארלוט, קרן יסוד Wachovia למצוינות סגל, ומענק מNIGMS (R15GM101571).

1. הכנת LSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפרדעי נשים (Xenopus laevis) מוזרקות פעמים לאיסוף ביצים. הזריקה הראשונה (יחול) היא 100 U PMSG (Mare הסרום גונדוטרופין הריון) לצפרדע. צפרדעים חייבות להיות דרוכות לפחות ימים לפני ביצת גרימת הנחת וצפרדעים דרוכות הן שמישות לתקופה של עד שבועות. לצפרדעי ממשלה, להזריק PMSG תת עורית בגב הצ&#39;קים הלימפה באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל ומחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום להטלת ביצים, להזריק 500 U (gonadotrophin כוריוני האנושי) hCG לצפרדע דרוכה תת עורי בגב הצ&#39;קים הלימפה באמצעות מחט 27 G. דגירת צפרדעים הזריקו בדלי נפרד המכיל 2 ליטר של הפתרון של 1x מארק modified של רינגר (MMR). אפשר צפרדעים 14-20 שעות כדי להטיל את ביצים לפני שהאוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצפרדעים מהדליים ולשפוך את פתרון MMR עד לסביבות 100 מ&quot;ל שנותר. להשיג ביצים מהדליים ידי העברת ביצים לכוס 250 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי Dejelly ידי הוספת 100 מ&quot;ל של ציסטאין 2% (להתאיםpH ל -7.8 עם 10 M KOH). ערבלו בעדינות את הביצים עם pipet הפוך זכוכית פסטר (0.7 סנטימטרי קוטר) בערך כל שנייה 30. למזוג ולהחליף עם ציסטאין הטרי פעמים במהלך דגירה. תהליך dejellying יושלם בכ 5-15 דקות, כאשר את הביצים ליצור שכבה מרוכזת יותר בתחתית הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את פתרון ציסטאין ולשטוף ביצים שלוש פעמים עם MMR 0.25x. לערבל את הביצים בפתרון על ידי pipet זכוכית. ביצים &quot;רעות&quot; נקבעות על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה ולבן &quot;נפוח&quot; בהופעה. את הביצים &quot;הרעות&quot; תצטברנה במרכז הכוס לאחר מתערבל. הסר ביצים &quot;רעות&quot; על ידי pipet פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביצים עם ביצת תמוגה חוצצת (ELB) שלוש פעמים. הסר את כל ביצים נוספות &quot;רעות&quot; על ידי pipet פסטר. יוצק את הביצים לתוך צינור 14 מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור פלקון עבור 55 שניות ב188 XG (1,100 סל&quot;ד) באמצעות צנטריפוגות הקלינית CL2 IEC טבלה העליונה עם הרוטור דלי מתנדנד לדחוס את הביצים. הסר חיץ עודף מעליון של שכבת הביצה. הוסף 0.5 μl של / מניות Aprotinin Leupeptin ו -0.5 μl של מניית B Cytochalasin למ&quot;ל של ביצים דחוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ביצים ב16500 XG (10,000 סל&quot;ד) במשך 15 דקות ב 4 ° C באמצעות Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed ​​עם הרוטור הדלי HB6 מתנדנד. לאחר צנטריפוגה, ביצים מופרדות לשלוש שכבות בצינור: שומנים, חילוץ וחלמון / פיגמנט מלמעלה עד למטה, בהתאמה. לנקב את הצד של צינור פלקון בחלק התחתון של שכבת תמצית האמצע עם מחט 21 G. מוציא בזהירות את המחט כפי שהכשילה את מחט הניקוב בפלסטיק. הכנס מחט טריה 21 G מחוברת למזרק 1 מ&quot;ל לאתר לנקב לאסוף את התמצית. לאט לשאוב לתוך מזרק התמצית, כדי למנוע בועות אוויר וזיהום מים עם השומנים וחלמון / פיגמנט שכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התמציות לתוך צינור microcentrifuge מצונן 1.5 מ&quot;ל. לכל מ&quot;ל של תמצית ביצים, להוסיף את פתרוני המניות הכימיות הבאים לריכוז סופי dicated (בסוגריים): (1) 10 Cycloheximide μl (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל); (2) 1 μl Aprotinin / Leupeptin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד); (3) 1 μl Cytochalasin B (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ); (4) 1 Dithiothreitol μl (מ&quot;מ 1); ו( 5) Nocodazole μl 0.33 (3 מיקרוגרם / מ&quot;ל). הפוך את הביצה לחלץ לפחות 10 פעמים בעדינות. זה LSE, שחייבת להתבצע טרי ולהשתמש בו בתוך 4 שעות. איכות LSE נפגעת לאחר 4 שעות או הקפאה, הפשרה. </li></ol> 2. טיפול בכרומטין הזרע עם DNA גישות לגרום ניזק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין זרע התקין על פי השיטה שתוארה בעבר 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין זרע MMS טופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הכרומטין זרע נורמלי ב0.5 מ&quot;ל המאגר X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ~ 5.5 μl של MMS (9.1 מ &#39;במלאי) עד 500 μl resuspended הכרומטין לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הכרומטין זרע בצינור microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ברוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מ &#39;צינור icrocentrifuge ב686 XG (2,100 סל&quot;ד) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר באמצעות צנטריפוגות הקלינית IEC CL2 עם הרוטור דלי מתנדנד ומתאמי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלול ב 0.5 מ&quot;ל של ההצפה X בתוספת BSA (3%), DTT (0.1 מ&quot;מ) וAprotinin / Leupeptin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים (4) ו (5) פעמים כדי לשטוף את הכרומטין הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הריכוז של הכרומטין זרע עם hemocytometer ולדלל ל100.000 זרע / μl. שמור 5 aliquots μl במקפיא ° C -80 לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין הזרע UV טופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סכום רצוי (10 μl למשל) של הכרומטין הזרע התקין על פני השטח של פיסת Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Parafilm לcrosslinker UV. הגדרת פרמטר רצוי אנרגיה, בהתאם לניסוי שלך, ולהתחיל לפגוע הכרומטין הזרע באמצעות אור UV. לדוגמה, זה לוקח כ 21 שניות כדי להגיע ל1000 J / מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר UV irradiation הכרומטין, UV טופל הזרע יש להוסיף לתמציות ביצים באופן מיידי. </li></ol></li></ol> 3. הכנת מבנה ה-DNA ניזק מחקים (AT70) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 2 oligonucleotides הסינטטי פולי-(DA) 70 (מיועד כA70) ופולי-70 (dT) (מיועד כT70) במים לריכוז של 2 מיקרוגרם / μl, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של A70 ו 100 μl של T70 לצינור microcentrifuge 1 1.5 מ&quot;ל. מרתיח פתרון מעורב סינטטי Oligo למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בheatblock. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בלוק האמבטיה היבשה החוצה (עם הצינור המכיל תערובת AT בו), ולתת לו להתקרר לטמפרטורת חדר על שולחן מעבדה. התאמת טמפרטורה זה לוקחת בערך 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התערובת המקוררת היא AT70 עם ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. 10 μl החנות של AT70 aliquots ב-20 ° C מקפיא לשימוש נוסף. </li></ol> 4. מפעיל מחסום הניזק לדנ&quot;א בLSE עם הכרומטין זרע הפגום או ניזק לדנ&quot;אמחקי מבנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסום לגרום ניזק לדנ&quot;א בLSE בכרומטין זרע פגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LSE לצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 ומשלים אותו עם μl 1 מתוך תערובת אנרגיה ו2 μl של הכרומטין זרע הפגום (ריכוז סופי ~ 4000 זרע / תגובת μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צינור התגובה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות ולהעיף את הצינור כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר μl 1 מתוך תערובת תגובה לשקופית מיקרוסקופ השלימה עם μl 1 מתוך פתרון לצבוע גרעיני לאחר דגירה 30-דקות. הנח תלוש כיסוי מעל תערובת התגובה ולבדוק להיווצרות גרעינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, גרעיני סיבוב יהוו לאחר 30 דקות של דגירה, המציין שכפול הדנ&quot;א יזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של תערובת התגובה ל90 μl של חיץ מדגם. דגימות מנותחות באמצעות immunoblotting באמצעות אנטי Chk1 P-S344 או נוגדנים כנגד Chk1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום ניזק לדנ&quot;א במחסום עם LSEAT70 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LSE לצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 בתוספת עם μl 1 מתוך תערובת אנרגיה ו -1.6 μl מניות Tautomycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.25 μl של AT70 המוכן מראש (2 מיקרוגרם / μl) או מים (כשליטה שלילית) לכל תגובה. דגירה את התגובות בטמפרטורת חדר במשך 90 דקות. פליק צינורות התגובה כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של תערובת התגובה ל90 μl של חיץ מדגם. דגימות נבדקות באמצעות immunoblotting באמצעות אנטי Chk1 P-S344 או נוגדנים כנגד Chk1. </li></ol></li></ol> 5. נציג תוצאות הכרומטין הזרע הפגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים יכול לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום ATR/Chk1-mediated במערכת תמצית ביצת Xenopus. מופעי 2A דמות שMMS גורם Chk1 זירחון בSer344 (Chk1 P-S344), המהווה אינדיקטור הפעלת קינאז ATR. 2B האיור מראה כי AT70, כמו ה-DNA ניזק מחקי struצלום, גם מפעיל Chk1 זרחון. דגימות Chk1 סך הכל משמשות כטעינת פקדים בשתי הדוגמות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> איור 1. תרשים של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> איור 2. Chk1 זירחון מושרה על ידי אחד MMS או AT70 טיפולים בתמציות Xenopus ביצים. () הזרע הכרומטין MMS שהניזוק (MMS) או הכרומטין הזרע הנורמלי (קון) מודגרת בתמציות ביצים עבור 90 דקות. Chk1 זירחון בSer344 (Chk1 P-S344) וChk1 המוחלט בתמציות ביצה נבחנים דרך immunoblotting. (ב) AT70 או מים (קון) מתווסף לתמציות ביצה, בהתאמה. דוגמאות גם מנותחות באמצעות immunoblotting כמו ב().

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ישנם מספר יתרונות בלימוד מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות תמציות Xenopus ביצים. השימוש בתמציות ביצה מספק כמות גדולה של תמציות תא חינם מסונכרנות בשלבי ביניים של מחזור התא. ניתן תמציות הביצים בקלות ובזול. זה יחסית קל לפגוע DNA או הכרומטין ולחשוף פגם במחסום הניזק לדנ&quot;א לא?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> Anti-P-S344 Chk1 נוגדן </td><td> איתות תא </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Chk1 </td><td> סנט קרוז </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> סיגמא </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352-1 ק&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> מתיל methanesulfonate (MMS) </td><td> סיגמא </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> סיגמא </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ מדגם </td><td> סיגמא </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako כימיקלי ארה&quot;ב </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> דלי להטלת ביצים </td><td> מוצרי Rubbermaid המסחריים </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה CL2 IEC עם הרוטור דלי מתנדנד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> הרוטור דלי HB6 נדנוד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> crosslinker UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 המ&quot;מימ NaCl, 2 המ&quot;מ KCl, 0.5 mM 4 MgSO, 2.5 המ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.8 עם 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / מניות Leupeptin </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד במים. אחסן 20 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> X החיץ </td><td></td><td></td><td> סוכרוז 0.2 מ &#39;, 80 המ&quot;מ KCl, 15 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.5 ידי HCl </td></tr><tr><td> מניית Cycloheximide </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasin B המניות </td><td></td><td></td><td> 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 20 aliquots μl ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> מניית Dithiothreitol (DTT) </td><td></td><td></td><td> M 1 במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 סוכרוז M, 1 mM DTT, 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל cycloheximide, 2.5 המ&quot;מ MgCl 2, 50 mM KCl, 10 HEPES מ&quot;מ, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole המניות </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 5 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> תערובת אנרגיה </td><td></td><td></td><td> פוספט 375 מ&quot;מ קריאטין, 50 mM ATP, ו25 מ&quot;מ MgCl 2. Aliquots נשמרים ב-80 ° C. </td></tr><tr><td> פתרון לצבוע גרעיני </td><td></td><td></td><td> 0.4 מיקרוגרם / המ&quot;ל Hoechst 33258, גליצרול 25%(V / v), ב1x PBS </td></tr><tr><td> מניית Tautomycin </td><td></td><td></td><td> 100 מיקרומטר בDMSO. אחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של עלבונות אנדוגניים וסביבתיים. כדי להתמודד עם העלבונות האלה, תאים התפתחו מחסום ניזק לדנ&quot;א איתות כמנגנון מעקב לחוש ניזק לדנ&quot;א ותגובות תאיות ישירות לניזק לדנ&quot;א. ישנן מספר קבוצות של חלבונים הנקראים חיישנים, מתמר וגורמים מעורבים באיתות מחסום ניזק לדנ&quot;א (איור 1). במסלול איתות מורכבת זו, ATR (כספומט וRad3 קשור) הוא אחד מקינאזות העיקרית שיכול להגיב לניזק לדנ&quot;א, ומתח שכפול. הפעיל ATR יכול phosphorylate מצעי מורדה כגון Chk1 (קינאז מחסום 1). כתוצאה מכך, פוספורילציה והפעיל Chk1 מוביל לתופעות רבות במורד מחסום הניזק לדנ&quot;א, כוללים מעצר מחזור תא, הפעלת שעתוק, תיקון ניזק לדנ&quot;א, ואפופטוזיס או הזדקנות (איור 1). כאשר ה-DNA פגומה, שלא הצליח להפעיל את תוצאות מחסום הניזק לדנ&quot;א בunrepניזק שודר, ועקב כך חוסר יציבות, הגנומי. המחקר של מחסום הניזק לדנ&quot;א יבהיר כיצד תאים לשמור על שלמות גנטית ולספק הבנה טובה יותר של איך מחלות אנושיות, כגון סרטן, להתפתח. תמציות Xenopus laevis ביצה מתגלות כמערכת חזקה תא חינם תמצית מודל במחקר מחסום ניזק לדנ&quot;א. תמצית מהירות נמוכה (LSE) בתחילה תארה Masui קבוצת 1. התוספת של הכרומטין הזרע demembranated לתוצאות LSE בהיווצרות גרעינים שבו DNA משוכפל באופנת semiconservative פעם אחת בכל מחזור התא. מסלול איתות מחסום ATR/Chk1-mediated מופעל על ידי ניזק לדנ&quot;א או מתח כפול 2. שתי שיטות עיקריות משמשת כיום כדי לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום: גישות מזיקות DNA ומבני ניזק-DNA מחק 3. ניזק לדנ&quot;א יכול להיגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV), γ-קרינה, מהתיל methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-התחמוצת (4-NQO), או aphidicolin 3, 4. MMS הוא סוכן אלקילציה שמעכב שכפול הדנ&quot;א ומפעיל את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated 4-7. קרינת UV גם מפעילה 8 מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-dependent. מבנה ה-DNA ניזק מחקי AT70 הוא מורכב משני annealed oligonucleotides פולי-(DA) 70 ופולי-70 (dT). AT70 המערכת פותחה במעבדתו של ביל דאנפי ונמצאת בשימוש נרחב כדי לגרום ATR/Chk1 איתות מחסום 9-12. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים (1) כדי להכין תמציות ביצת תא חינם (LSE), (2) לטיפול בכרומטין זרע עם DNA Xenopus שתי שונים לפגוע גישות (MMS ו UV), (3) כדי להכין את מבנה ה-DNA ניזק המחקים AT70, ו( 4) כדי לעורר את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated בLSE בכרומטין זרע פגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ&quot;א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ&quot;א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.6K Views.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ"א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ"א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ"א.

Video: Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

חקר מחסום הניזק לדנ"א באמצעות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א

ייצור של

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב

זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral