يوفر هذا البروتوكول إجراءً تدريجيًا لتذوق الطبقات الفرعية للغشاء شبه البيض من بيض الطيور لإجراء مزيد من البحث عن دورها الفسيولوجي في تكاثر الطيور. وقد تم تحسين أخذ العينات من غشاء مابيتيلين في كل خطوة للحد من أي أضرار الهيكلية والجزيئية. وقد تم تطوير البروتوكول بشكل أكبر للبروتيوميات المعمقة.
تبدأ عن طريق أخذ العينات طبقة ما بينتينيلين أو PL من البيض وضعت حديثا غير المخصبة. كسر البيضة واستخدام فاصل البيض لفصل صفار من الأبيض. إزالة chalazae مع مقص صغير ولفة صفار على ورقة مرشح لإزالة الألبومين المتمسك الذي يظهر كبنية شفافة ولكن مرئية.
غمر صفار في متبلور يحتوي على 10 ملليمتر تريس HCL في الرقم الH8 التي تم تبريدها سابقا إلى أربع درجات مئوية وإزالة منطقة PL على القرص الجرثومي داخل منطقة سنتيمتر واحد باستخدام مقص حاد. تمزق PL مع مقص صغير داخل المخزن المؤقت، ثم عقد حواف اثنين من PL تمزق مع ملقط وقشر قبالة صفار. شطف PL عدة مرات في الحمامات من 10 ملليمولار تريس HCL حتى لا أثر صفار مرئيا.
تأكد من أن PL نظيفة، والأبيض، والعائمة في المخزن المؤقت. معالجة PL لفصل الطبقة الفرعية أو المضي مباشرة إلى التحليلات الكيميائية الحيوية. لفصل OPL و IPL ، انشر العينة بأكملها مع OPL التي تواجه في طبق بيتري البلاستيكي المليء بـ 10 ملليمولار تريس HCL و 50 ملليمولار كلوريد الصوديوم والحفاظ عليه مسطحًا مع أقل عدد ممكن من التجاعيد.
تحديد موقع chalazae المتبقية التي يتم إرفاقها فقط إلى OPL. ثم قطع PL كامل إلى قطع من حوالي اثنين في ثلاثة سنتيمترات مع مقص صغير. فصل ميكانيكيا طبقتين مع ملقط طرف دقيقة جدا تحت المجهر تشريح.
تخزين العينات IPL و OPL الناتجة بشكل فردي في أنابيب صغيرة في درجة مئوية سلبية 80 حتى مزيد من الاستخدام. لأداء سولوبيبليونية البروتين الأولية، وتجميد الجافة العينات IPL و OPL بشكل فردي لإزالة المياه المتبقية، ثم قطع ما يقرب من ملليغرام واحد من كل عينة ووضعها داخل أنبوب صغير نظيفة مع غطاء المسمار واقية من التسرب. الاحتفاظ العينات المتبقية في أنابيب مغلقة بإحكام للتخزين لفترات طويلة في السلبية 20 أو السلبية 80 درجة مئوية.
مزيج مليغرام واحد من كل طبقة فرعية مlyophilized مع 400 ميكرولترات من 50 ملليمولار تريس في pH سبعة و 500 ملليمولار كلوريد الصوديوم. استخدام طاحونة خلاط مرتين لمدة خمس دقائق في 30 هيرتز لتفكك الهياكل إلى جزيئات صغيرة وتسهيل solubilization البروتين. جمع 400 ميكرولترات من العينات في اثنين من أنابيب صغيرة نظيفة.
لتحضير العينات للكهربية، أضف 5X SDS-PAGE عينة عازلة لكل عينة ميكرولتر 400 وسخّنها إلى 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحميل ما لا يزيد عن 20 ميكروغرام من البروتينات في كل حارة من 4-20٪ التدرج SDS هلام polyacrylamide وتنفيذ الكهرباء في 120 فولت. بعد electrophoresis، إزالة الجل من لوحات الزجاج وصمة عار مع محلول Coomassie الأزرق الرائعة لمدة 30 دقيقة، ثم إزالة وصمة عار مع محلول يتكون من 50٪ ماء، 40٪ الإيثانول و 10٪ حمض الخليك حتى تظهر خلفية هلام الأزرق الفاتح.
نقل هلام في طبق بيتري التي تحتوي على المياه الأيونية لإزالة البقع وإعادة الترطيب. يجب أن تظهر البروتينات كشرائط زرقاء مع خلفية شفافة. وقد أُخضعت الـ PL لمخازن عازلة مختلفة لتحديد الظروف التي تسمح بالحد الأدنى من فقدان البروتين والفصل الأمثل للطبقات الفرعية.
يتم عرض البروتين الذي يطلق بتركيزات تريس مختلفة، والدرجات الهزية، وتركيزات كلوريد الصوديوم هنا. ولوحظت الطبقات الفرعية الناتجة تحت مجهر تشريح. IPL شفافة في حين أن OPL كثيفة ، غائمة ، وwhyish.
بعد الانفصال ، تم تحلل OPL و IPL بشكل مستقل وتم حل محتواها من البروتين تمامًا باستخدام مزيج من الطحن الميكانيكي ، والمنظفات أنيونية ، وكيل تقليل ، والغليان. أظهرت العينات ملامح كهرباء متميزة على هلام البولي أكريلاميد. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن فصل الطبقات الفرعية هو خطوة حاسمة في الإجراء ويجب إجراؤه باستخدام مجهر منظار في مخزن يحتوي على الحد الأدنى من تركيز الملح.
ولزيادة توضيح وظيفتها الفسيولوجية، يمكن تحليل عينات الطبقة الفرعية للغشاء شبه البنفسجي للتوصيف النسيجي باستخدام المجهر الإلكتروني وللدراسات الوظيفية باستخدام مقايسات التصوير وهجرة الخلايا.
