עבודה זו נתמכת כספית על ידי NIH (מענקים 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), פרס הקריירה של NSF (1653702) ואוניברסיטת קונטיקט.

1. סינתזה של JBNTs
הערה: מונומר JBNT הוכן כפי שפורסם בעבר11.
<ol><li>סינתזה של תרכובת A1<ol>
<li>הכן פתרון המכיל 8.50 גרם של חומצה 2-ציאנואצטית ו 9.80 גרם של אתילקרבמאט ב 25 מ"ל של טולואן ו 2.5 מ"ל של N, N-dimethylformamide. הוסף 4.90 מ"ל של זרחן כלוריד dropwise. לאחר מכן מחממים את התערובת ל 70 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 1.5 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ויוצקים פנימה 100 גרם מי קרח. לחלץ את השכבה מימית עם אצטט אתיל (3 x 250 מ"ל), ולשטוף עם 100 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים נדיפים תחת ואקום כדי לקבל מוצק צהוב חיוור.</li>
		<li>הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (3% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 15.61 גרם של תרכובת A1 כאבקה לבנה.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A2<ol>
<li>מערבבים 3.12 גרם של תרכובת A1 ו 2.75 גרם של אשלגן פחמתי ב 50 מ"ל של N, N-דימתילפורממיד. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.</li>
		<li>הוסף 2.6 מ"ל של פחמן דיסולפיד להשעיית התגובה. ממשיכים לבחוש במשך 4 שעות.</li>
		<li>מוסיפים אתנול מוחלט לתערובת התגובה ב 0 מעלות צלזיוס. מסננים את הצהוב מזרזים החוצה ולשטוף עם אתר diethyl. יבש תחת ואקום בן לילה כדי להניב 6.18 גרם של תרכובת A2 כמו מוצק צהוב חיוור.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A3<ol>
<li>הוסף 2.7 מ"ל של מתיל יודיד ב 15 מ"ל של אצטוניטריל. כמו כן, בנפרד להכין פתרון של תרכובת A2 על ידי הוספת 6.18 גרם של A2 כדי 80 מ"ל של מים / אצטוניטריל (יחס 7:3). מערבבים את שני הפתרונות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
		<li>מחממים את תערובת התגובה ל 95 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 3 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר, ואז מתאדים את הנדיפים תחת ואקום.</li>
		<li>לחלץ את השאריות 3x עם 100 מ"ל של אתיל אצטט ולשטוף עם מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג מוצק צהוב.</li>
		<li>הכפיף את מוצק צהוב כדי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (30% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 4.52 גרם של המתחם A3 כמו מוצק צהוב בהיר.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A4<ol>
<li>הכן פתרון אליאמין על ידי הוספת 925 μL של אליאמין ב 20 מ"ל של אתנול. הוסף פתרון זה dropwise לפתרון של תרכובת A3, מוכן על ידי הוספת 3.14 גרם של A3 ב 75 מ"ל של אתנול מוחלט, מעל 30 דקות. לאחר מכן מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ומאדים את הנדיפים כדי לתת מוצק צהוב.</li>
		<li>הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (50% אתיל אצטט/הקסנים ל-2% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.80 גרם של תרכובת A4 כקריסטל לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A5<ol>
<li>הוסף 2.05 גרם של גואנידיניום הידרוכלוריד ו 7.8 מ"ל של נתרן אתוקסיד (21 wt% באתנול) ב 14 מ"ל של אתנול מוחלט. מחממים את התערובת ל 45 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.</li>
		<li>לסנן את החומר מסיס ולהוסיף את הסינון ישירות לתוך הפתרון של תרכובת A4, מוכן על ידי הוספת 2.70 גרם של A4 ב 40 מ"ל אתנול מוחלט. מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.</li>
		<li>לסנן את המשקעים החוצה כדי לקבל 2.65 גרם של תרכובת A5 כמו מוצק לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A6<ol>
<li>הוסף 24.9 מ"ל של טריאתילאמין לאט לתערובת תרחיף המתקבל על ידי הוספת 2.11 גרם של תרכובת A5 ו 1.10 גרם של 4-דימתילאמינופירידין ב 120 מ"ל של טטרהידרופורן מעל 1 דקות. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 20.7 מ"ל של די-טרט-בוטיל דיקרבונט לתערובת התגובה וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 40 שעות.</li>
		<li>הוסף 20 מ"ל של מים כדי להרוות את התגובה. לאדות את volatiles תחת ואקום.</li>
		<li>לחלץ את שאריות צמיג אדום עם 500 מ"ל של אתיל אצטט. לאחר מכן, לשטוף אותו עם 250 מ"ל של מים, 75 מ"ל של 10% חומצת לימון, 2x עם 200 מ"ל של מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצק אדום/כתום.</li>
		<li>הכפיף את מוצק chromatography עמוד פלאש ג'ל סיליקה (0-20% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 3.87 גרם של תרכובת A6 כמו קצף לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A7<ol>
<li>הוסף N-מתילמורפוליין N-תחמוצת (50 wt.% במים, 1.64 מ"ל) dropwise לפתרון של תרכובת A6 (2.93 גרם) באצטון / מים (8:1, 58.5 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>מוסיפים אוסמיום טטראוקסיד (4% פתרון מימי) טיפה לתערובת על פני תקופה של 3 דקות וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.</li>
		<li>להרוות את התגובה עם 1.0 M מימית נתרן גופרתי עד הפתרון הופך חסר צבע. הסר את volatiles תחת ואקום כדי לגרום תרחיף לבן במים. לחלץ את השאריות עם 350 מ"ל של dichloromethane ולאחר מכן לשטוף עם 150 מ"ל של מים ואחריו לשטוף עם 150 מ"ל של מלח.</li>
		<li>יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להניב 2.45 גרם של תרכובת A7 כמוצק לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A8<ol>
<li>הוסף 760 גרם של תקופת נתרן לתערובת של 1.36 גרם של תרכובת A7 ב 35 מ"ל של דיכלורומתאן / מים (6:1, 35 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 42 שעות.</li>
		<li>מסננים את החומר הבלתי מסיס ומרכזים את הסינון תחת ואקום. לחלץ את השאריות וכתוצאה מכך עם 250 מ"ל של dichloromethane, ולאחר מכן לשטוף עם 100 מ"ל של מים ו 100 מ"ל של מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת את המוצר הגולמי.</li>
		<li>הכפפ את המוצר הגולמי לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (5-40% אתיל אצטט/הקסנים, ולאחר מכן 5% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.08 גרם של תרכובת A8.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A9<ol>
<li>הכן פתרון של 830 מ"ג של תרכובת A8 ב 15 מ"ל של 1,2-dichloroethane. הוסף את הפתרון של dropwise לתערובת של 6-בנזילוקסיקקרבונילמינו-2-L-אמינו-hexanoic חומצה טרימתילסיליל אתיל אסתר (649.5 מ"ג) ו N,N-diisopropylethylamine (591 μL) ב 24 מ"ל של 1,2-dichloroethane מעל 3 דקות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 360.3 מ"ג נתרן triacetoxyborohydride לפתרון וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.</li>
		<li>להרוות את תערובת התגובה עם 6 מ"ל של מים. לחלץ את תערובת התגובה 3x עם 200 מ"ל של דיכלורומתאן ולשטוף עם 200 מ"ל של 10% חומצת לימון במים, 2x עם 200 מ"ל מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח בסדר זה. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג את המוצר הגולמי.</li>
		<li>הכפיפה את המוצר הגולמי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (5-30% אתיל אצטט / הקסנים) להניב 885 תרכובת מ"ג A9.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של מונומר JBNT<ol>
<li>להמיס 0.54 גרם של תרכובת A9 (0.54 גרם) ב 10 מ"ל של 94% תמיסת חומצה trifluoroacetic / thioanisole ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 72 שעות.</li>
		<li>מוסיפים אתר diethyl (80 מ"ל) לתערובת התגובה וצנטריפוגה משקעים למטה. יוצקים את החומצה trifluoroacetic ברור המכיל supernatant החוצה ולשטוף את המשקעים הלבנים עם אתר diethyl ומתנול להניב 168.6 מ"ג מונומר JBNT גס (קובץ משלים 1).</li>
		<li>טיהור מונומר JBNT גולמי על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודת פאזה הפוכה. תוכנית הבידוד מפורטת להלן: ממס A: 100% מים; ממס B: 100% אצטוניטריל; ממס C: pH = 1 פתרון מים HCl; קצב זרימה: 3 מ"ל / דקה (ראה טבלה 1).</li>
		<li>לאסוף את הפסגה הגדולה ביותר בערך 7.2 דקות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ייצור עבור JBNT / FN
<ol><li>הוסף 80 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNT פתרון מימית 40 μL של 1 מ"ג / מ"ל FN פתרון מימית פיפטה מספר פעמים.</li>
	<li>בדוק אם יש נוכחות של מתלה מוצק לבן לאחר pipetting במשך כ 10 s. הערה: סרטון צולם כדי ללכוד את תהליך ההרכבה העצמית של NM (קובץ משלים 2).</li>
</ol>3. התבוננות בדגימות לויאופיליות
הערה: שלב זה מבוצע כדי להציג את מבנה הפיגומים של NM עשוי JBNTs ו- FN.
<ol><li>הכן פתרונות FN, JBNT ו- FN / JBNT NM לתצפית חומרים ליאופיליים. לדלל 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של FN עם 40 μL של מים מזוקקים לעשות פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל של FN.</li>
	<li>הכן 100 מ"ג / מ"ל פתרון של JBNTs על ידי דילול 5 μL של 1 JBNTs מ"ג / מ"ל ב 45 μL של מים DI.</li>
	<li>מערבבים 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs ב 35 μL של מים DI כדי ליצור את הפתרון NM.</li>
	<li>מעיל שלוש בארות של מיקרופלטות עגולות עגולות ברורות 96-היטב עם FN, פתרון JBNT ופתרון NM, בהתאמה. כל באר מקבלת 50 μL של הפתרון.</li>
	<li>בצע lyophilization, כמתואר להלן, כדי לדמיין את מבנה הפיגומים של NM.<ol>
<li>להקפיא את הצלחת ב -80 מעלות צלזיוס לילה.</li>
		<li>הפעל את המכשיר lyophilized ומשאבת ואקום.</li>
		<li>לחץ על כפתור הקירור כדי להפחית את הטמפרטורה של המערכת ל -50 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>מכניסים את הצלחת הקפואה לתוך המכשיר lyophilized ולסגור את כל פתחי המכשירים.</li>
		<li>לחץ על לחצן התחל כדי להפחית את לחץ המערכת ל- 0.9 mbar.</li>
		<li>לאחר 4 שעות, לחץ על כפתור aerate ולפתוח את השסתום כדי להגביר את לחץ המערכת ללחץ האטמוספרי.</li>
		<li>תוציא את הצלחת מהמכשיר הליאופילי.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן ב- FN, JBNTs וב- NM שהרכיב את עצמו. צלם מספר תמונות עם מצלמה לחומרים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מדידת ספקטרום ספיגה
הערה: השתמש בשינוי הספקטרום עבור FN ו- JBNTs כדי להציג את JBNT / FN NM12שהרכיב את עצמו .
<ol><li>מערבבים 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 15 μL של מים מזוקקים ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNTs להכין את הפתרון JBNT / FN NM. השעיה מוצקה לבנה ניתן לראות לאחר pipetting הפתרון מספר פעמים. הערה: הריכוזים הסופיים של JBNTs ו- FN בתמיסה הם 100 מיקרוגרם / מ"ל ו 60 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. פתרונות JBNTs ו- FN באותו ריכוז לזה המשמש בפתרון NM הוכנו גם כפתרונות בקרה.</li>
	<li>לדלל 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs עם 45 μL של מים מזוקקים כדי להכין פתרון בקרת JBNT.</li>
	<li>לדלל 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 20 μL של מים מזוקקים כדי להכין את פתרון בקרת FN.</li>
	<li>למדוד את ספקטרום הספיגה UV-vis של פתרונות FN, JBNT ו JBNT / FN NM עם ספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים)כדי לאפיין את ההרכבה של NM.<ol>
<li>לחץ על לחצן UV-Vis. לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של מים מזוקקים על זה. למדוד אותו ריק מ 190-850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון FN על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה UV-Vis של פתרון FN מ 190 ננומטר עד 850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT / FN NM על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT / FN NM מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הכנת JBNT / FN NM להעברת מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM)
<ol><li>נקה מספר רשתות לפני כתמים שליליים עם מנקה פלזמה בסיסי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע את הכתמים השליליים לדגימות לאחר שני תהליכים שונים.<ol>
<li>שחרר 3 μL של 1 מ"ג / מ"ל של פתרון מימי JBNTs ו 3 μL של פתרון JBNT / FN NM על רשתות מופרדות ולהשאיר אותו במשך 2 דקות. לאחר מכן לשטוף כל רשת עם 100 μL של 0.5% Uranyl אצטט (UA) פתרון. מסננים את הפתרון העודף עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשתות.</li>
		<li>לערבב 9 μL של פתרון JBNT / FN NM עם 3 μL של 2.0% פתרון UA ופיפט אותו מספר פעמים. פיפטה הפתרון המעורב על הרשתות ולשמור אותו על הרשתות במשך 2 דקות. השתמש בנייר סינון כדי להסיר את הפתרון המעורב מהרשתות ולייבש את הרשתות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבסוף, לאפיין את הדגימה עבור JBNTs, JBNT / FN NM מוכתם בשלב 5.2.1, ו JBNT / FN NM מוכתם עם שלב 5.2.2 עם TEM.</li>
</ol>6. במבחנה ביולוגית פונקציה מבחנה
<ol><li>הוסף 200 μL של פקדים שליליים (NC, PBS), JBNTs, FN ופתרונות JBNT / FN NM לבאר אחת של שקופית 8 בארות, בהתאמה.</li>
	<li>להקפיא לייבש את כיסוי 8-היטב תאים עם המכשיר lyophilized לציפוי חומרים בתחתית בארות. הפרוטוקול לייבוש הקפאה זהה לשלב 3.5.</li>
	<li>לאחר מכן להוסיף 10,000 תאים / בארות hMSCs (מעבר 3) לתוך הבארות ולהדגיר אותם במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, פיפטה את מדיום תרבות התא מן הבארות ולשטוף את התרבות עם פתרון 1x PBS.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הפתרון המתקן לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 5 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>מדללים 1% טריטון-X 100 עד 0.1%. הוסף 100 μL של 0.1% טריטון-X 100 לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 10 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>לדלל את הרודמין Phalloidin ל 1.65 מיקרומטר. להוסיף 100 μL של רודמין Phalloidin לכל באר עם תאים דגירה כיסוי התאי שמירה על אור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>לכוד את תמונות התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>ספירת מספרי התאים בתמונות פלואורסצנטיות עבור כל קבוצה. לחשב את צפיפות הידבקות התא על ידי ממוצע של שלושה אזורים אקראיים בכל באר.</li>
	<li>הצג את כל הנתונים כסטיית תקן (SD) ± ממוצעת. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t חד-זנבי, ואחריו ניתוח שונות (ANOVA) עם p<0.05, הנחשב מובהק סטטיסטית.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של NanoDe Therapeutics בע"מ.

במחקר זה פיתחנו NM ביומימטי בהרכבה עצמית, אשר נוצר עם JBNTs בהשראת DNA ו- FN. בעת הכנת פתרון JBNT, אבקת lyophilized JBNT צריך להיות מומס לתוך המים במקום PBS כי PBS יגרום agglomeration של JBNTs, אשר מעכב את ההרכבה שלהם. יתר על כן, NM צריך גם להיות מורכב במים אם אנחנו רוצים לבחון את המבנים ננו סיבי של NM, כי המלח ב- PBS יהיה צרור ע...

תאי גזע mesenchymal האנושי (hMSCs) הראו את הפוטנציאל להתחדשות עצמית ובידול עצמי לאורך שושלת mesenchymal שונים, אשר מסייע התחדשות ותחזוקה שלרקמות 1. בהתבסס על פוטנציאל הבידול, hMSCs נחשבים כמועמדים לפציעות רקמה mesenchymal וטיפול בהפרעה hematopoietic2. hMSCs הראו את היכולת לקדם ריפוי פצעים על ידי הגדלת תיקון רקמות, אנגיוגנזה, והפחתת דלקת3. עם זאת, ללא סיוע ביוכימי או ביו-חומרים, היעילות של hMSCs להגיע לרקמת יעד ולתפקד במיקום הרצוי היא נמוכה4. למרות פיגומים מהונדסים שונים נוצלו כדי למשוך hMSCs לדבוק בנגעים, אתרים מסוימים כגון שבר צלחת צמיחה, באמצע עצם ארוכה, אינם נגישים בקלות על ידי פיגומים קונבנציונליים מראש מפוברק, אשר לא יכול להתאים באופן מושלם לתוך אתר פצוע בצורה לא סדירה.
כאן, פיתחנו ננו-חומר ביו-מימטי שיכול להרכיב את עצמו במקום ולהזריק אותו לאזור מטרה שקשה להגיע אליו. NM ביו פיגום להזרקה מורכב צינורות בסיס יאנוס (JBNTs) ו פיברונקטין (FN). JBNTs, הידוע גם בשם צינורות רוזט (RNTs), נגזרים זוגות בסיס DNA, במיוחד תימין אדנין, כאן5,6,7. כפי שניתן לראות באיור 1, הננו-צינוריות נוצרות כאשר שש מולקולות של בסיס הדנ"א הנגזר מרכיבות את עצמן באמצעות קשרי מימן ויוצרותמישור 6. שש מולקולות נערמות זו על זו במישור באמצעות אינטראקציית pi-stacking חזקה7, אשר יכול להיות עד 200-300 מיקרומטר אורך. JBNTs נועדו לחקות מורפולוגית סיבי קולגן כך FN יגיב איתם.
FN הוא דבק במשקל מולקולרי גבוה גליקופרוטאין, אשר ניתן למצוא במטריצה חוץ תאית (ECM)9. אלה יכולים לתווך את ההחזקה של תאי גזע לרכיבים אחרים של ECM, במיוחד קולגן10. עיצבנו JBNTs לחקות סיבי קולגן באופן מורפולוגי כך FN יכול להגיב איתם כדי ליצור NM בעוד כמה שניות באמצעות מליטה noncovalent. לכן, NM הוא ביו פיגום מבטיח להיות מוזרק לתוך אתר שבר עצם כי לא יכול להיות נגיש על ידי פיגומים מפוברק קונבנציונלי. כאן, NM להזרקה מציג יכולת מצוינת כדי לשפר את מעגן hMSC במבחנה, מציג את הפוטנציאל שלהם לשמש פיגום עבור התחדשות רקמות.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroethane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-cyanoacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrated hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl dicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>ethylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>methyl iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine N-oxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>phosphoryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>potassium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>reverse phase column</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>silica gel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>sodium ethoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>sodium triacetoxyborohydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

NM ביומימטי פותחה כדי לשמש פיגום ביולוגי הנדסת רקמות, אשר יכול לשפר את עגינה תאי גזע. ה- NM הביומימטי נוצר מ- JBNTs ו- FN באמצעות הרכבה עצמית בתמיסה מימית. JBNTs למדוד 200-300 מיקרומטר אורך עם ערוצי חלול הידרופובי פנימי משטחים הידרופיליים החיצוניים. JBNTs מחויבים באופן חיובי ו- FNs מחויבים באופן שלילי. לכן, כאשר מוזרק לתוך פתרון מימית ניטרלי, הם מלוכדים יחד באמצעות מליטה noncovalent כדי ליצור את חבילות NM. תהליך ההרכבה העצמית הושלם תוך שניות ספורות ללא יוזמים כימיים, מקור חום או אור UV. כאשר רמת ה- pH של פתרון NM נמוכה מהנקודה האיזואלקטרית של FNs (pI 5.5-6.0), חבילות NM יופצו באופן עצמאי עקב נוכחות של FN טעון באופן חיובי.
NM ידוע לחקות את המטריצה חוץ תאית (ECM) מורפולוגית ולכן, יכול לשמש פיגום להזרקה, אשר מספק פלטפורמה מצוינת כדי לשפר את הידבקות hMSC. ניתוח צפיפות התא וניסויי הדמיית פלואורסצנטיות הצביעו על כך שה- NMs הגדילו באופן משמעותי את העיגון של רכיבי HMSCs בהשוואה לבקרה השלילית.

המחקרים שלנו גילו כי היווצרות NM של JBNTs ו FN הוא מהיר, אשר קרה ב 10 שניות. כפי שמוצג באיור 2, פלוקולה לבנה הושגה כאשר פתרון JBNT היה מעורבב עם פתרון FN ו pipetted מספר פעמים. תהליך היווצרות של NM הוא ביומימטי לחלוטין. אין צורך בגירויים חיצוניים. תהליך הייצור הוא הרבה יותר קל מזה של כמה biomater...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Views.  University of Connecticut. מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

Video: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo uses. The addition of growth factors into these biomaterial scaffolds is generally done to provide an optimal cell culture environment, mediating cell differentiation and its subsequent functions. However, the growth factors in a conventional biomaterial scaffold are typically designed to be released upon implantation, which could result in unintended side effects on surrounding tissue or cells. Here, the DNA-inspired Janus base nano-matrix (JBNm) has successfully achieved a highly localized microenvironment with a layer-by-layer structure for self-sustainable cartilage tissue constructs. JBNms are self-assembled from Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and transforming growth factor beta-1 (TGF-&#946;1) via bioaffinity. The JBNm was assembled at a TGF-&#946;1:matrilin-3:JBNt ratio of 1:4:10, as this has been the determined ratio at which proper assembly into the layer-by-layer structure could occur. First, the TGF-&#946;1 solution was added to the matrilin-3 solution. Then, this mixture was pipetted several times to ensure sufficient homogeneity before the addition of the JBNt solution. This formed the layer-by-layer JBNm, after pipetting several times again. A variety of experiments were performed to characterize the layer-by-layer JBNm structure, JBNts alone, matrilin-3 alone, and TGF-&#946;1 alone. The formation of JBNm was studied with UV-Vis absorption spectra, and the structure of the JBNm was observed with transmission electron microscopy (TEM). As the innovative layer-by-layer JBNm scaffold is formed on a molecular scale, the fluorescent dye-labeled JBNm could be observed. The TGF-&#946;1 is confined within the inner layer of the injectable JBNm, which can prevent the release of growth factors to surrounding areas, promote localized chondrogenesis, and promote an anti-hypertrophic microenvironment.

This protocol describes the assembly of a layer-by-layer Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold by adding Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-&#946;1) sequentially. The JBNm was fabricated and characterized; additionally, it displayed excellent bioactivity, encouraging cell functions such as adhesion, proliferation, and differentiation.

ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...