Bu çalışma NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Kariyer Ödülü (1653702) ve Connecticut Üniversitesi tarafından finansal olarak desteklenmektedir.

1. JBNT'lerin Sentezi
NOT: JBNT monomer daha önce yayınlandı olduğu gibi hazırlanmıştır11.
<ol><li>Bileşik A1 sentezi<ol>
<li>25 mL toluen ve 2,5 mL N, N-dimetilformamid içinde 8,50 g 2-siyanoasetik asit ve 9,80 g etilkarbamat içeren bir çözelti hazırlayın. Damla yönünde 4,90 mL fosforel klorür ekleyin. Daha sonra karışımı 70 ° C'ye ısıtın ve 1,5 saat karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve 100 g buzlu su dökün. Sulu tabakayı etil asetat (3 x 250 mL) ile çıkarın ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, soluk sarı bir katı elde etmek için uçucuları vakum altında filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%3 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz bir toz olarak 15,61 g bileşik A1 elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>A2 bileşiği sentezi<ol>
<li>3.12 g bileşik A1 ve 2.75 g potasyum karbonatı 50 mL N, N-dimetilformamid karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon süspansiyonu için 2,6 mL karbon disülfid ekleyin. 4 saat karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımına 0 °C'de mutlak etanol ekleyin. Sarı çökeltiyi filtreleyin ve dietil eter ile yıkayın. Soluk sarı katı olarak 6,18 g bileşik A2 elde etmek için vakum altında bir gecede kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>A3 bileşiği sentezi<ol>
<li>15 mL asetonitril içine 2,7 mL metil iyodür ekleyin. Ayrıca, 6,18 g A2 ila 80 mL su/asetonitril (7:3 oranı) ekleyerek ayrı ayrı bir A2 bileşik çözeltisi hazırlayın. Hem çözeltileri karıştırın hem de oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını 95 °C'ye ısıtın ve 3 saat boyunca karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve ardından uçucuları vakum altında buharlaştırin.</li>
		<li>Kalıntıyı 100 mL etil asetat ile 3x çıkarın ve salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, sarı bir katı elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%30 etil asetat/hexanes) maruz kalarak A3 bileşiğin 4,52 g'ını açık sarı katı olarak elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>A4 bileşiği sentezi<ol>
<li>20 mL etanol içine 925 μL allylamin ekleyerek alllamin çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi, 75 mL mutlak etanolde 3,14 g A3 eklenerek hazırlanan bileşik A3 çözeltisine damla yönünde ekleyin, 30 dakikadan fazla. Daha sonra reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve sarı bir katı vermek için uçucuları buharlaştırin.</li>
		<li>Sarı katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%50 etil asetat/heksanlar %2 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz kristal olarak 1,80 g bileşik A4 elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>A5 bileşiği sentezi<ol>
<li>14 mL mutlak etanol içine 2,05 g guanidinyum hidroklorür ve 7,8 mL sodyum etoksit (etanolde% 21 wt) ekleyin. Karışımı 15 dakika boyunca 45 °C'ye ısıtın.</li>
		<li>Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı doğrudan 40 mL mutlak etanol içine 2,70 g A4 ekleyerek hazırlanan A4 bileşiği çözeltisine ekleyin. Reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.</li>
		<li>2,65 g bileşik A5 elde etmek için çökeltmeyi beyaz olmayan bir katı olarak filtreleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A6 sentezi<ol>
<li>1 dakika boyunca 120 mL tetrahidrofuranda 2,11 g bileşik A5 ve 1,10 g 4-Dimetilaminopyridine eklenerek elde edilen bulamaç karışımına yavaşça 24,9 mL trietilamin ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımına damla yönünde 20,7 mL di-tert-butil dikarbonat ekleyin ve oda sıcaklığında 40 saat karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyonun söndürülmesi için 20 mL su ekleyin. Uçucuları vakum altında buharlaştır.</li>
		<li>Kırmızı viskoz kalıntıyı 500 mL etil asetat ile çıkarın. Ardından, 250 mL su, 75 mL% 10 sitrik asit, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, kırmızı/turuncu bir katı vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%0-20 etil asetat/heksanes) vererek beyaz köpük olarak 3,87 g bileşik A6 elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A7 sentezi<ol>
<li>Aseton/suda (8:1, 58,5 mL) A6 (2,93 g) bileşik çözeltisine damla yönünde N-metilmorfolin N-oksit (suda% 50 wt.% ekleyin) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Karışıma 3 dakikalık bir süre boyunca damla yönünde osmiyum tetraoksit (%4 sulu çözelti) ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Çözelti renksiz olana kadar reaksiyonun 1.0 M sulu sodyum sülfit ile söndürülmesi. Suda beyaz bir bulamaca neden olmak için vakum altındaki uçucuları çıkarın. Kalıntıyı 350 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 150 mL su ile yıkayın ve ardından 150 mL salamura ile yıkayın.</li>
		<li>Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, beyaz bir katı olarak 2,45 g bileşik A7 elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A8 sentezi<ol>
<li>35 mL dikloromethane/suda (6:1, 35 mL) 1,36 g bileşik A7 karışımına 760 g sodyum periodide ekleyin ve 42 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı vakum altında yoğunlaştırın. Elde edilen kalıntıyı 250 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 100 mL su ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Ham ürünü silika jel flaş kolon kromatografisine (%5-40 etil asetat/altıgen, daha sonra %5 metanol/dikloromethane) 1,08 g bileşik A8 verimine tabi tutunun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A9 sentezi<ol>
<li>1,2-dikloroetan 15 mL'de 830 mg bileşik A8 çözeltisi hazırlayın. Damlacık çözeltisini 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-heksanoik asit trimetilsilyl etil ester (649.5 mg) karışımına ekleyin ve N,N-diisopropylethylamine (591 μL) 24 mL'de 1,2-dikloroetan 3 dakika boyunca karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Çözeltiye 360,3 mg sodyum triacetoxyborohidrit ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını 6 mL su ile söndürin. Reaksiyon karışımını 200 mL diklorometan ile 3x çıkarın ve suda% 10 sitrik asit 200 mL, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Ham ürünü 885 mg bileşik A9 elde etmek için silika jel flaş sütun kromatografisine (%5-30 etil asetat/heksanes) tabi edin.</li>
	</ol></li>
	<li>JBNT monomer sentezi<ol>
<li>0,54 g bileşik A9 'ı (0,54 g) %94 trifluoroasetik asit/tiyoanisol çözeltisinin 10 mL'sinde çözün ve oda sıcaklığında 72 saat karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımına dietil eter (80 mL) ekleyin ve çökeltmeyi santrifüjleyin. Süpernatant içeren berrak trifluoroasetik asidi dökün ve beyaz çökeltiyi 168,6 mg ham JBNT monomer(Ek Dosya 1)elde etmek için dietil eter ve metanol ile yıkayın.</li>
		<li>Ham JBNT monomerini, ters faz sütununa sahip yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) ile arındırın. İzolasyon programı aşağıda listelenmiştir: Solvent A: % 100 su; solvent B: %100 asetonitril; solvent C: pH=1 HCl su çözeltisi; akış hızı: 3 mL/dk (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>Yaklaşık 7.2 dakikada en büyük zirveyi toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. JBNT / FN için İmalat
<ol><li>40 μL 1 mg/mL FN sulu çözeltiye ve pipete birkaç kez 80 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 10 s pipetlemeden sonra beyaz katı süspansiyonun varlığını kontrol edin. NOT: NM'nin kendi kendine montaj sürecini yakalamak için bir video çekildi (Ek Dosya 2).</li>
</ol>3. Liyofilize örneklerin gözlemlenmesi
NOT: Bu adım, JBNT'lerden ve FN'den yapılan NM'nin iskele yapısını göstermek için gerçekleştirilir.
<ol><li>Lyophilized malzeme gözlemi için FN, JBNT ve FN/JBNT NM çözümlerini hazırlayın. 20 μg/mL'lik bir FN çözeltisi yapmak için 10 μL 100 μg/mL FN'yi 40 μL damıtılmış su ile seyreltin.</li>
	<li>45 μL DI suda 5 μL 1 mg/mL JBNT seyrelterek 100 mg/mL JBNT çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>NM çözeltisini oluşturmak için 35 μL DI suda 10 μL 100 μg/mL FN ve 5 μL 1 mg/mL JBNT karıştırın.</li>
	<li>Sırasıyla FN, JBNT çözümü ve NM çözümü ile 96 kuyulu yuvarlak alt mikro plakalardan oluşan üç kuyuyu kapla. Her kuyu 50 μL çözelti alır.</li>
	<li>NM'nin iskele yapısını görselleştirmek için aşağıda açıklandığı gibi liyofilizasyon gerçekleştirin.<ol>
<li>Plakayı gece boyunca -80 °C'de dondurun.</li>
		<li>Lyophilized cihazı ve vakum pompasını açın.</li>
		<li>Sistemin sıcaklığını -50 °C'ye düşürmek için soğuma düğmesine basın.</li>
		<li>Donmuş plakayı liyofilize enstrümana koyun ve aletlerin tüm açıklıklarını kapatın.</li>
		<li>Sistem basıncını 0,9 mbar'a düşürmek için başlat düğmesini tıklatın.</li>
		<li>4 saat sonra, havalandırma düğmesine basın ve sistem basıncını atmosferik basınca artırmak için vanayı açın.</li>
		<li>Tabağı teofiliz aletinden çıkar.</li>
		<li>FN, JBNT'leri ve ortaya çıkan kendi kendine monte edilmiş NM'yi gözlemlemek için bir mikroskop kullanın. Malzemeler için bir kamera ile birkaç fotoğraf çekin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Absorpsiyon spektrum ölçümü
NOT: Kendi kendine monte edilmiş JBNT / FN NM12'yisunmak için FN ve JBNT'ler için spektrum değişikliğini kullanın.
<ol><li>JBNT/FN NM çözeltisini hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 15 μL damıtılmış su ve 5 μL 1 mg/mL JBNT ile karıştırın. Çözeltiyi birkaç kez pipetledikten sonra beyaz katı süspansiyon görülebilir. NOT: Çözeltideki son JBNT ve FN konsantrasyonları sırasıyla 100 μg/mL ve 60 μg/mL'dir. NM çözümünde kullanılana aynı konsantrasyonda JBNT'ler ve FN çözümleri de kontrol çözümleri olarak hazırlanmıştır.</li>
	<li>JBNT kontrol çözeltisini hazırlamak için 5 μL 1 mg/mL JBNT'yi 45 μL damıtılmış su ile seyreltin.</li>
	<li>FN kontrol çözeltisi hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 20 μL damıtılmış su ile seyreltin.</li>
	<li>NM'nin montajını karakterize etmek için FN, JBNT ve JBNT/FN NM çözeltilerinin UV-vis emme spektrumunu spektrofotometre ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>UV-Vis düğmesini tıklatın. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL damıtılmış su bırakın. 190-850 nm arasında boş olarak ölçün.</li>
		<li>Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL FN çözeltisi bırakın. FN çözeltisinin UV-Vis emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.</li>
		<li>Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT çözeltisi bırakın. JBNT çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.</li>
		<li>Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın. JBNT/FN NM çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. İletim elektronik mikroskopisi (TEM) için JBNT/FN NM hazırlanması
<ol><li>Temel plazma temizleyici ile negatif boyamadan önce birkaç ızgarayı temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>İki farklı işlemi takiben numuneler için negatif boyama gerçekleştirin.<ol>
<li>Ayrı ızgaralara 3 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ve 3 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın ve 2 dakika bekletin. Ardından her ızgarayı %0,5 uranil asetat (UA) çözeltisinin 100 μL'si ile durulayın. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı ile boşaltın ve ızgaraları havayla kurutun.</li>
		<li>9 μL JBNT/FN NM solüsyonunun 3 μL%2,0 UA çözeltisi ile karıştırın ve birkaç kez pipetlayın. Pipet ızgaralar üzerinde karışık çözelti ve 2 dakika boyunca ızgaralarda tutun. Karışık çözeltiyi ızgaralardan çıkarmak ve ızgaraları oda sıcaklığında kurutmak için bir filtre kağıdı kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Son olarak, numuneyi JBNT'ler, adım 5.2.1 ile lekelenmiş JBNT/FN NM ve TEM ile 5.2.2 adımı ile lekelenmiş JBNT/FN NM için karakterize edin.</li>
</ol>6. In vitro biyolojik fonksiyon tahlil
<ol><li>200 μL negatif kontrol (NC, PBS), JBNT, FN ve JBNT/FN NM çözümlerini sırasıyla 8 iyi odalmış bir slayt kuyusuna ekleyin.</li>
	<li>Kuyuların dibindeki malzemeleri kaplamak için 8 kuyulu odalı örtü örtüsünü liyofilize aletle dondurun. Dondurarak kurutma protokolü adım 3.5 ile aynıdır.</li>
	<li>Daha sonra kuyulara 10.000 hücre /kuyu hMSC (Passage 3) ekleyin ve % 5 CO 2 ile 37 °C'de24saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, hücre kültürü ortamını kuyulardan dışarı atın ve kültürü 1x PBS çözeltisi ile durulayın.</li>
	<li>Her kuyuya 100 μL sabitleyici çözelti ekleyin ve 5 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Seyreltin 1% Triton-X 100 ila% 0.1. Her kuyuya 100 μL% 0.1 Triton-X 100 ekleyin ve 10 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Rhodamine Phalloidin'i 1,65 μM'ye seyreltin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Floresan mikroskopla hücre görüntülerini yakalayın.</li>
	<li>Her grup için floresan görüntülerdeki hücre numaralarını sayın. Her kuyuda üç rastgele alanın ortalamasını alarak hücre yapışıklık yoğunluğunu hesaplayın.</li>
	<li>Tüm verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. Tek kuyruklu bir t testi kullanarak istatistiksel analizler yapın, ardından istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilen p<0.05 ile varyans analizi (ANOVA).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Dr. Yupeng Chen, NanoDe Therapeutics, Inc.'in kurucu ortağıdır.

Bu çalışmada, DNA'dan ilham alan JBNT'ler ve FN ile oluşturulan kendi kendine monte edilmiş bir biyomimetik NM geliştirdik. JBNT çözeltisini hazırlarken, JBNT liyofilize tozu PBS yerine suya çözülmelidir, çünkü PBS, montajlarını engelleyen JBNT'lerin aglomerasyonuna neden olacaktır. Ayrıca, NM'nin nano-fibril yapılarını gözlemlemek istiyorsak NM de suda monte edilmelidir, çünkü PBS'deki tuz, görüntülerin çözünürlüğünü büyük ölçüde azaltabilecek NM lifleri ile birlikte gelecektir....

İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC'ler), dokuların yenilenmesine ve bakımına yardımcı olan farklı mezenkimal soylar boyunca kendini yenileme ve kendini farklılaştırma potansiyelini göstermiştir1. Farklılaşma potansiyeline dayanarak, hMSC'ler mezenkimal doku yaralanmaları ve hematopoetik bozukluk tedavisi için aday olarak kabul edilir2. hMSC'ler doku onarımını, anjiogenezini artırarak ve iltihabı azaltarak yara iyileşmesini teşvik etme yeteneğini göstermiştir3. Bununla birlikte, biyokimyasal veya biyomalzemeler yardımı olmadan, hMSC'lerin bir hedef dokuya ulaşması ve istenen yerde çalışması için verimlilik düşüktür4. Lezyonlara yapışmak için hMSC'leri çekmek için çeşitli tasarlanmış iskeleler kullanılsa da, uzun bir kemiğin ortasındaki büyüme plakası kırığı gibi bazı bölgelere, düzensiz şekilli bir yaralı bölgeye mükemmel bir şekilde sığmayan geleneksel önceden imal edilmiş iskeleler tarafından kolayca erişilemez.
Burada, kendi kendine yerinde monte edilebilen ve ulaşılması zor bir hedefe enjekte edilebilen bir biyomimetik nanomalzeme geliştirdik. Enjekte edilebilir biyo-iskele NM, Janus baz nanotüpler (JBNTs) ve fibronektinden (FN) oluşur. Rozet Nanotüpleri (RNTs) olarak da bilinen JBNT'ler, DNA baz çiftlerinden, özellikle timin ve adenden türetilir, burada5,6,7. Şekil 1'degörüldüğü gibi, nanotüpler, türetilmiş DNA tabanının altı molekülü hidrojen bağları aracılığıyla kendi kendine birleşerek bir düzlem oluşturduğunda oluşur6. Daha sonra altı molekül, 200-300 μm uzunluğa kadar olabilen güçlü bir pi istifleme etkileşimi7aracılığıyla bir düzlemde birbirlerine yığılır. JBNT'ler morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarlanmıştır, böylece FN onlarla reaksiyona girecektir.
FN, hücre dışı matriste (ECM)9bulunan yüksek moleküler ağırlıklı yapışkan glikoproteindir. Bunlar kök hücrelerin ECM'nin diğer bileşenlerine, özellikle kollajen10'abağlanmasına aracılık edebilir. JBNT'leri morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarladık, böylece FN onlarla reaksiyona girerek kararsız bağlanma yoluyla birkaç saniye içinde NM oluşturabilir. Bu nedenle, NM, geleneksel olarak imal edilmiş iskeleler tarafından erişilemeyen bir kemik kırılma bölgesine enjekte edilecek umut verici bir biyo-iskeledir. Burada, enjekte edilebilir NM, doku yenilenmesi için bir iskele görevi görebilme potansiyellerini sergileyen hMSC ankraj in vitro'yu geliştirmek için mükemmel bir yetenek sunar.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroethane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-cyanoacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrated hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl dicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>ethylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>methyl iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine N-oxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>phosphoryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>potassium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>reverse phase column</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>silica gel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>sodium ethoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>sodium triacetoxyborohydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Kök hücre ankrajını artırabilen bir doku mühendisliği biyolojik iskelesi olarak hizmet edecek bir biyomimetik NM geliştirilmiştir. Biyomimetik NM, sulu bir çözeltide kendi kendine montaj yoluyla JBNT'lerden ve FN'den oluşturulur. JBNT'ler iç hidrofobik içi boş kanallar ve dış hidrofilik yüzeylerle 200-300 μm uzunluğundadır. JBNT'ler pozitif olarak ve FN'ler negatif olarak ücretlendirilir. Bu nedenle, nötr sulu bir çözeltiye enjekte edildiğinde, NM demetlerini oluşturmak için yaygın olmayan yapıştırma yoluyla birbirine bağlanırlar. Kendi kendine montaj işlemi, herhangi bir kimyasal başlatıcı, ısı kaynağı veya UV ışığı olmadan birkaç saniye içinde tamamlanır. NM çözeltisinin pH'ı FN'lerin izoelektrik noktasından (pI 5.5-6.0) daha düşük olduğunda, NM demetleri pozitif yüklü FN varlığı nedeniyle kendiliğinden serbest kalacaktır.
NM'nin hücre dışı matrisi (ECM) morfolojik olarak taklit ettiği bilinmektedir ve bu nedenle, hMSC yapıştırmasını geliştirmek için mükemmel bir platform sağlayan enjekte edilebilir bir iskele olarak kullanılabilir. Hücre yoğunluğu analizi ve floresan görüntüleme deneyleri, NM'lerin negatif kontrole kıyasla hMSC'lerin ankrajını önemli ölçüde artırdığını gösterdi.

Çalışmalarımız, JBNT ve FN'nin NM oluşumunun hızlı olduğunu keşfetti, bu da 10 saniyede gerçekleşti. Şekil 2'degösterildiği gibi, JBNT çözeltisi FN çözeltisi ile karıştırıldığında ve birkaç kez pipetlendiğinde beyaz flokül elde edildi. NM'nin oluşum süreci tamamen biyomimetiktir. Harici uyaranlara gerek yoktur. İmalat süreci, çapraz bağlantı için ultraviyole ışık veya kimyasal başlatıcıya dayanan bazı gelişmekte olan biyomalzemelerden çok daha<su...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC' ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM'ler hMSC'lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.

Kök Hücre Yapışması için Janus Baz Nanotüpler ve Fibronektin ile Biyomimetik Nano Matris İmalatı

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Görüntüleme.  University of Connecticut. Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC' ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM'ler hMSC'lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.

Video: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Biyomühendislik

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Fiber Teşkilatı geçişleri ile electrospun Nanolif iskeleleri

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Termal Nanoimprinting teknik ve insan endotel hücreleri koloni oluşturan yanıt testi ile taranması degrade Nanopattern imalatı

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo uses. The addition of growth factors into these biomaterial scaffolds is generally done to provide an optimal cell culture environment, mediating cell differentiation and its subsequent functions. However, the growth factors in a conventional biomaterial scaffold are typically designed to be released upon implantation, which could result in unintended side effects on surrounding tissue or cells. Here, the DNA-inspired Janus base nano-matrix (JBNm) has successfully achieved a highly localized microenvironment with a layer-by-layer structure for self-sustainable cartilage tissue constructs. JBNms are self-assembled from Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and transforming growth factor beta-1 (TGF-&#946;1) via bioaffinity. The JBNm was assembled at a TGF-&#946;1:matrilin-3:JBNt ratio of 1:4:10, as this has been the determined ratio at which proper assembly into the layer-by-layer structure could occur. First, the TGF-&#946;1 solution was added to the matrilin-3 solution. Then, this mixture was pipetted several times to ensure sufficient homogeneity before the addition of the JBNt solution. This formed the layer-by-layer JBNm, after pipetting several times again. A variety of experiments were performed to characterize the layer-by-layer JBNm structure, JBNts alone, matrilin-3 alone, and TGF-&#946;1 alone. The formation of JBNm was studied with UV-Vis absorption spectra, and the structure of the JBNm was observed with transmission electron microscopy (TEM). As the innovative layer-by-layer JBNm scaffold is formed on a molecular scale, the fluorescent dye-labeled JBNm could be observed. The TGF-&#946;1 is confined within the inner layer of the injectable JBNm, which can prevent the release of growth factors to surrounding areas, promote localized chondrogenesis, and promote an anti-hypertrophic microenvironment.

This protocol describes the assembly of a layer-by-layer Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold by adding Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-&#946;1) sequentially. The JBNm was fabricated and characterized; additionally, it displayed excellent bioactivity, encouraging cell functions such as adhesion, proliferation, and differentiation.

Kıkırdak Rejenerasyonunu Teşvik Etmek için Katman Katman Janus Baz Nano-Matrisinin Üretimi ve Karakterizasyonu

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...