המחברים מבקשים להודות וללהכיר במועצה למחקר הרפואית למימון מחקר זה - G1000788-98812 קוד מענק MRC-DPFS.

ייצור ועיקור 1.Scaffold <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר PCL ב1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol לתת 10% w / v ריכוז. כפי שתואר בוסוורת &#39;ואח&#39;, 9 electrospin פתרון פולימרים (הפרמטרים: 20 kV, 1 מיליליטר / שעה, 20 סנטימטרים). ולאסוף מיושר סיבים על קצה mandrel מסתובב (600 סל&quot;ד). עם אזמל להסיר את הסרט של סיבים שנאספו ואז לחתוך לאורכים קצרים יותר - 3 סנטימטר (לשקתות וכלי סיבוביים) ו- 4 סנטימטר (לתרבית תאים מוסיף) אורכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קנס להטביע רצועות בודדות במים מזוקקים ולהסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק שני הקצוות בין האגודל לאצבע; לסובב ידני את הרצועה עד שדומה חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לצלול הפיגום דמוי חוט הזה במים מזוקקים ומניח על אי-סיבי כרטיס נקי, לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיבש מקום, בנפרד בצינורות microcentrifuge נקיים ולהוסיף 1 מיליליטר של 50% אתנול v / v במים מזוקקים. סגור את המכסים ולהשאיר למשך 24 שעות. הערה: בצע את השלבים תחת זרימה למינרית הבאה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות microcentrifuge בזרימה למינרית ולשאוב את פתרון v / v 50%. החלף עם 1 מיליליטר אתנול 70% v / v במים מזוקקים, קרובים מכסים ומשאירים למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור 90% ו 100% אתנול v / v במים מזוקקים (1 מיליליטר כרכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיגומי פעמיים עם תמיסת מלח פוספט (PBS), 24 שעות לכל לשטוף (2 x 1 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהחליף עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר. הערה: פיגומים מוכנים לשעת שימוש לאחר 24. </li></ol> 2. קביעת שטח פן פיגום ומספר התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ההדמיה מיקרוסקופ ואור, למדוד את הקוטר של חוט electrospun לאורכו כדי לקבוע ערך ממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תניח חוט להיות מוט גלילי ולהתקרב לשטח פנים באמצעות: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפה פני שטח =, r = רדיוס וh = אורך הערה: השטח היה מחושב להיות 18902, 800 מיקרומטר 2. יתר על כן, יש לציין כי השטח בפועל יהיה גדול יותר מחישוב זה כחוט מורכב ממאות סיבים עדינים, אשר יגדילו את שטח הפנים. כתוצאה מכך מספר גדול יותר של תאים צריך להיות מסוגל לצרף אל הגרדום. עם זאת, זה לא משפיע על השוואה ישירה בין קבוצות בדיקה שנעשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר המרבי של תאים שיכולים לצרף אל פני השטח הפיגום נחשף על ידי: הערה: שימוש בתוכנת מיקרוסקופ והדמיה אור, הקוטר של תאי גזע mesenchymal האדם היה נחוש להיות 20 מיקרומטר (תאי הנחה הם עגולים), ולכן במקרה זה, מספר התאים = 60200. </li></ol> 3. פיגום Set-up - Cell תרבות תוספות (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, לפתוח את התרבות מוסיף תא 6-גם סטרילי ולהפריד את הטבעות קצרות עם שיניים מהגופים רחבות מוקפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הטבעת עם שיניים מצביעות כלפי מעלה. לעטוף אחדשל פיגומי 4 סנטימטרים מעל מרכז הטבעת לוודא שזה חופף בשני הצדדים. קח את הגוף ועמדה מוקפים על טבעת השיניים ופיגום ולדחוף כלפי מטה כדי לוודא שהפיגום נשאר בעמדה והשקרים דרך המרכז של להכניס את תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום להכניס תרבית תאים עם פיגום לתוך הבאר של היטב 6, צלחת מחייבת נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לפיגום. </li></ol> 4. פיגום Set-up - שוקת (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, פולי המקום (tetrafluoroethylene) (PTFE) שקתות לצלחות פטרי אישיות ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לשוקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לעטוף אחד 3 פיגומי סנטימטרים לתוך השוקת, כדי לוודא שאורכו נמצא במקביל לקצה הארוך של השוקת. </li></ol> 5. פיגום Set-up - כלי Bioreactor (איור 1 ג) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, להפריש 10 מיליליטר PBS סטרילי באמצעות כלי של bioreactorנמל ועיקרי להשאיר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולהחליף עם תקשורת והתרבות 8 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להכניס אחד מפיגומי 3 סנטימטר לתוך הכלי דרך היציאה הראשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הנמל הראשי. </li></ol> ספירת 6. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים גזע mesenchymal (hMSC) נגזרים ממח עצם על פי פרוטוקול עד למעבר 4 לפני קציר יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מסנטימטר 75 2 בקבוק המכיל hMSCs נגזר ממח עצם (קטע 4, confluency 80%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS ולשאוב 10 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר טריפסין ודגירת הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים וחילצה ממשטח הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 מיליליטר תקשורת ותרבות כדי להשבית את האנזים ולהעביר נפח זה כולל (10 מיליליטר) לצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend השעיה תא זה על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר הומוגנית תאים בתוךתקשורת וagglomerates תא גבול (10 פיפטה מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 20 μl של השעיה תא והעברה לhaemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את haemocytometer תחת מיקרוסקופ אור ותמונה במטרת x10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס קווי הרשת ולספור את מספר התאים ב4 x 4 ריבועים בכל פינה של הרשת ואשר נופלים בתוך הריבוע ואלה החוצים את יד ימין או קו גבול תחתון. רוזן לכל סט של 4 x 4 ריבועים (4 סעיפים לרשת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ספירת resuspension ותא שלוש פעמים (שלבים 6.6-6.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ספירת תאים הממוצעת ולקבוע את עוצמת הקול של מדיה הנדרשת לresuspension תא (תא ריכוז 60200 ב -200 μl). לדוגמא, לקבוע את ספירת תאים הממוצעת מhaemocytometer ולאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע הכולל של תאים משלושה סעיפים נפרדים. תכפיל את זה ב 1 x 10 4 לתת מספר התאים למ&quot;ל, ואז להכפיל בנפח הכולל של השעיה תא לתת למספר הטל של תאים. השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע נפח של תקשורת הנדרשת לresuspension: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב241 XG במשך 5 דקות. </li></ol> זריעת 7. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מצינור centrifuged עוזב את התא גלולה ולהחליף עם מחושב נפח התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים והתקשורת אפילו לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה Gilson P200, לוותר לאט 200 μl של השעיה תא על כל פיגום על ידי הפעלת קצה פיפטה לאורך הפיגום ומתחת לפני השטח הנוזלי תקשורת. השאר באין מפריע במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלי bioreactor, לוותר 200 μl של השעיה תא דרך היציאה הראשית. Top-עד התקשורת נותרה 2 מיליליטר התרבות דרך יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר. </li></ol> 8. ניסויי התחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי bioreactor לbioreactor RCCS-4DQ ולהגדיר כדי לסובב בשעה 9 בסל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראןספיר הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות לצלחת שייקר ולהגדיר כדי לסובב ב 30 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות למדף של חממת תא נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (תרבות סטטית). </li></ol> 9. DNA Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות - מאגר תמוגה, מאגר 1x TE, תקני ה- DNA ופתרון עובד DNA תא - בהתאם להנחיות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להסיר את הדגימות מהחממה ולמקם תחת הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השברים תקשורת מכל המדגמים ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. צנטריפוגה הצינורות 241 XG. הסר את supernatant ולהוסיף למאגר תמוגה 3 מיליליטר. Resuspend הפתרון להתפרקות התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להסיר את הפיגומים ומקום בצינורות צנטריפוגה המכילים 3 מיליליטר חיץ תמוגה (לפיגומים בתוך כלי bioreactor, להסיר את הפיגום לפני aspiratingקוטר). לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא, לשחרר ראשון פיגום על ידי חיתוך הפיגום בסמוך לשפת של insert באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של חיץ תמוגה לכל כלי קיבול פיגום ולגרד את פני השטח (במרץ להתסיס לכלי bioreactor). הסר את מאגר תמוגה ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כל צינור צנטריפוגות במשך כ 1 דק &#39;על מנת להבטיח תסיסה מספקת של התאים וחיץ ולעודד תמוגה של קרום התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת גם שחורה 96, להוסיף למאגר תמוגה 100 μl לכל חלק מדגם - פיגום, תקשורת וגם (לשכפל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחושך, להוסיף של פתרון ה- DNA תא 100 μl לכל הבארות המכילות מאגר תמוגה ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל בארות עם חיץ תמוגה מכיל לא פתרון ה- DNA ו- DNA של התאים כדי לספק שליטה שלילית וחיובית לצלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת-קורא הקרינה, למדוד את הספיגה של הבארs באמצעות 485 ננומטר עירור ופליטת 520 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות את הנתונים עם עקומת הסטנדרט שנוצרה מתקני ה- DNA על פי הוראות היצרן. </li></ol> 10. סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ קיבוע (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים תחת זרימה למינרית: לאחר 4 שעות, להסיר את כל הפיגומים מהקיבול והמקום שלהם בתוך צלחת 6-היטב חדשה (בארות נפרדות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים על הספסל הפתוח: כל אחד היטב, להוסיף 2 מיליליטר של 1.5% glutaraldehyde v / v בPBS, כדי להבטיח כיסוי של הפיגום מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת למשך 30 דקות מינימום ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבוע תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מקבע ולשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הפיגומים עם הגדלת ריכוזים של אתנול במים מזוקקים מתחילה עם 50% v / v, ואחריו 70% v / v ו- 90% v / v. עבור כל ריכוז, submerse מלא הפיגומים בsolution (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 3 דקות. מחק את הפתרון וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש באתנול 100% על ידי submersing מלא הפיגומים בפתרון (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימי לייבש את הפיגומים באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS) בתוך ארון קטר. לטבול את הפיגומים בHMDS (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. הסר את HMDS וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את HMDS ולאפשר הפיגומים לייבוש. הר הפיגומים של ספחי SEM זמינים מסחרי (במקרה זה ספחי נירוסטה עם כרטיסיות פחמן דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על הצפייה בSEM, מעיל הדגימות באמצעות coater זהב-גמגום למשך 2 דקות על מנת להבטיח כיסוי דק ואפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקום בתוך SEM ולדמיין את פיגומי תא זרע באמצעות קרן אלקטרונים 5 קאב. </li></ol>

<ol>
	<li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells.">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li><li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR's.">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426 (2012).</li><li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2/VEGF-A+signaling+pathway.">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li><li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li><li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds.">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li><li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering.">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li><li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair.">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li><li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds..">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds..</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li><li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular,+aligned,+and+contractile+blood+vessels.">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li><li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering:+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro.">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li><li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface.">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guan,+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase.">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li><li>Grant, D. S., Tashiro, K. -. I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro.">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li><li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+cell+seeding,+cultivation+parameters,+and+tissue+construct+characterization.">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מטריצות סיבי electrospun מפוברקות מbiopolymers משמשות באופן קבוע כדי לתמוך מצורף תא ושגשוג עבור יישומים ביולוגי ו / או הנדסת רקמות 11,12. במקרים אלה, המטריצות הן לעתים קרובות סדינים דקים של סיבים בקלות לכסות את כל הבסיס של צלחת גם תרבית תאים ובכך נמצאים בקשר מלא עם תאי זרע אשר משפר מצורף תא. עם זאת, אם הפיגום הביולוגי אינו מכסה את הבסיס של הצלחת גם באופן מלא, יש סיכוי גבוה שחלק גדול מתאי זרע לא יישאר במגע עם הפיגום וסופו של דבר לא תוכל לצרף. מחקר זה בדק כמה שיטות שונות לזריעת תאים על פיגומים שאינך מכסים את הבסיס של הצלחת גם, על מנת לקבוע טכניקה מותאמת שיכול להיות מומלצת לניסויים מבוססי תאי עתיד. חמישה סט-אפים שונים נחקרו (איור 1): scaffoLDS (חוט electrospun) שנערך באמצעות מוסיף תרבית תאים בתוך צלחות גם מחייב נמוכים וגם כל הזמן תחת תנאים סטטיים או מזועזע ליום 30 בסל&quot;ד; פיגומים ממוקמים בתוך שקתות PTFE צרות והחזיקו סטטי או מזועזעים ליום 30 בסל&quot;ד; ופיגומים שוכנו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9. קביעת מספר התאים שדבקו בחוטי electrospun ידי assay DNA הוכיח אחוז נמוך של קובץ מצורף לכל להגדיר קופצים זריעה (איור 2); וזה אושר גם מסריקת micrographs אלקטרונים (SEM) (איור 3). קובץ מצורף גדול תא - 30% או ~ 18060 תאים ד&quot;ר גינזבורג נצפה לחוטים שהוחזקו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לתנועה רציפה. מעניין, קובץ מצורף הנמוך ביותר תא (15%) הושג עבור חוטים שנערכו על ידי התרבות מוסיף תא אבל כל הזמן תחת תנאים סטטיים, אשר הייתי מציע כי הכללת תנועת רדיאלי יש השפעה חיובית על שמירת תאים במגע עם הפיגום. עם זאת,יש לציין כי מלקחיים רציפים של הזרימה של התקשורת עשויים להיות אחראים לagglomerates התא נצפה מתמונות SEM. הצלחת שייקר נקבעה על ההגדרה הנמוכה ביותר שלה - 30 סל&quot;ד - אשר יכולה להיות מגבלה להגדרה זו. בתנועות איטיות רדיאלי עשויה לעזור למנוע או להפחית את מסכת תא וגם יכול לשפר מצורף תא כמו תאים חווים פחות כוח. ניסויים עתידיים צריכים להתמקד באופטימיזציה של המהירות שייקר האידיאלית עבור קובץ מצורף תא משופר. שילוב תנועה לחוטים שנערכו בתוך השקתות לא הביא למגמה דומה, עם שני תרחישי מניב קובץ מצורף 18% (~ 10836 תאים); למרות שזה יכול להיות בגלל הציפה החלקית של הפיגומים בתוך השקתות (נצפה לשקתות מונחות על הצלחת שייקר) כפי שהם אינם מעוגנים לבסיס. צף חלקי של הפיגום ימנע את כל תאים ששקעו לתחתית השוקת מלבוא במגע עם החומר והדבקות. לtההגדרה המסוימת שלו, השוקת שכנה בתוך צלחת פטרי וסך הכל 10 מיליליטר נפח התקשורת הוסיף. הממדים הקטנים של השוקת אומר כי הרוב המכריע של התקשורת קיים בתוך צלחת פטרי ואם יש תנועה, תאים עשויים להתרחק מן השוקת לצלחת פטרי ולהישאר לגמרי מחוץ להישג ידם של הפיגום. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניסויים נוספים צריכים לכלול צעד נוסף בפרוטוקול, לפיה את הקצוות של הפיגומים שהוצמדו לבסיס של השקתות באמצעות קנס-מחטים סטריליות, כיוון שזו צריכה למנוע הציפה והתנועה (במיוחד שלהם לפיגומים החשופים ל תנועת רדיאלי), שסופו של דבר צריך להוביל לעלייה במספר התאים הקשורים בפיגום. 16% מתאים שמחוברים לחוטים הנוכחיים בתוך כלי סיבוביים. למרות היותו טכניקה מבוססת היטב לתרבות 3D, בעיות לא מתעוררות עם הסרת פיגומים מהנמל העיקרי של כלי, אשר עשויים להסתיים באופן רופף ATTACתאי הד לאיבוד. כלי שניתן לפתוח באופן מלא היה למנוע את הבעיה; אלה זמינים לרכישה, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר כלי חד פעמי המשמשים במחקר זה. מחקר זה מדגים את הבעיות הנוכחיות עם זריעת פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. זריעת מספר תא ידוע הביאה פחות מ מצרף שלישית לפיגום, למרות שטח הפנים של הפיגום המאפשרים לכל התאים לדבוק. לכך יכולה להיות השלכות מזיקות במבחנים מבוססי תאים אחרים שעשויים להעריך את ההתאמה הביולוגית ותא-חומר / תאי תאי ההתנהגות ואינטראקציות עם הפיגום כהתקן רפואי עתידי אפשרי. מגבלות נוספות של המחקר עשויות לכלול את נקודת זמן 4 שעות - למרות היותו מספיק זמן כדי להבטיח זריעת תאים ראשונית (תאים הוכחו לצרף היטב למצעים בתוך שלושים דקות 13,14,15), זה עשוי להיות סביר בvestigate נקודות הזמן מאוחר יותר מתן תאים אינם מתרבים במסגרת זמן ארוכה יותר כמו זה שאחרת להטות את מספר התא מתחיל. הקטנת הנפח של תקשורת, במקרה זה 10 מיליליטר, יכול גם לשפר את הקשר בין התאים והפיגום וסופו של דבר להגדיל את קובץ מצורף תא. מחקרים עתידיים צריכים לקחת בחשבון גם את כדאיויות תא כתהליך של זריעת תאים יכול לגרום לניזק לתאים ו / או תא מות 16. מבחני DNA התא אינם מבחינים בין תאי קיימא ולא ברי קיימא, כמו assay מת / כגון חי, למשל, הייתי להדגיש את רמת הכדאיות. חקירה זו מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים שמייחסים לפיגום למרות זריעת כמות ידועה. ללימודים המסתמכים על מספר ההתחלה של תאים, חשוב מאוד שחוקרים יודעים בדיוק כמה של דמות שאכן לדבוק במצע של עניין.

פיגומים באופן שיגרתי בשלבי פיתוח ומחקר ליישומים ביולוגי והנדסת רקמות. ככזה, הם זורעים בדרך כלל עם תאים וההתנהגות במבחנה שלהם מאופיינים באמצעות מבחני הקובעים שגשוג תאים ומספר תא, למשל. בניסויים כגון אלה, קיימים הכרח כי מספר התאים הראשוני ידוע ולעתים קרובות חוקרים לקבוע את ריכוז הזריעה במונחים של מספר התאים למ&quot;ל או 2 סנטימטר. בזמן הזה הוא תרגול טוב, בעיקר למטרות בהיקף של עד, זה אינו לוקח בחשבון את המספר האמיתי של תאים שידבקו אל פני השטח הפיגום (שהוא גם תלוי במאפייני ההדבקה של פני השטח הביולוגי 1). הדבר נכון במיוחד עבור פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של הצלחת גם תרבית התאים כמו תאים עלולים ליפול מהמבנה ו, בשל האופי לעתים קרובות סטטית של הניסוי, ייתכן שלעולם לא יחזרו במגע עם החומר של inteשאר. חוטי electrospun סיבים הם דוגמא טובה של פיגום שאינו מכסה את הבסיס של הבאר (איור 1 א). במקרה זה, יש להשתמש בצלחות גם מחייב נמוכים שלא היו שטופל פני השטח כדי למנוע מתאים הקשורים בשטח של הצלחת ולכן מעוותים את התוצאות של assay כל מבוסס היטב. הצלחות גם משמשות בקלות לזריעת תאים על פיגומים, אבל הם לא השיטה היחידה זמינה. מערכות תרבית תאי רוטרי, סוג של bioreactor שפותח על ידי החטיבה למדעי החיים בנאס&quot;א בשנת 1980 מאוחר, יכולות לשמש באופן דומה לזרע פיגומים בסביבה תלת-ממדית (3D) עם כביד מדומה. סוג זה של bioreactor עדיין בחירה פופולרית עם חוקרים ברחבי העולם וכבר שולב במחקרים לתא איתות 2,3, תאי גזע והנדסת רקמות 4,5 6,7. מה שעושה את bioreactor הסיבובי עדיף על צלחות גם הוא התחזוקהשל סביבת 3D, אשר מסייעת במניעת תאים מובחנים מdedifferentiating, כפי שקורה לעתים קרובות כאשר בתרבית בתוך תנאי 2D קונבנציונליים 8. מאמר זה חוקר טכניקות שונות לזריעת תאי גזע mesenchymal אנושיים על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוטי סיבים כמפוברקים בוסוורת &#39;et al., 9 במטרה למקסם את המספר הראשוני של תאים הקשורים בפיגומים האלה בתוך תקופה של 4 שעות. לתרבות 2D, חוטים נערכו באופן מאובטח בתוך צלחות גם או פולי מחוייט (tetrafluoroethylene) שקתות (PTFE) והמשיכו בתנאים סטטיים, או מזועזע ליום 30 בסל&quot;ד. לתרבות 3D, חוטים ותאים הוחזקו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9.

<table><tbody><tr><td>Distilled water</td><td>in-house supply</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline solution</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC culture media</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Warmed to 37 oC before use</td></tr><tr><td>Supplement mix</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Antibiotic/antimyotic mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Warmed to 37 &amp;#176;C before use</td></tr><tr><td>Cell culture flasks (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Low binding 6-well plates</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-well CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petri-dish 50 ml deep</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>PTFE troughs</td><td>in-house production</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Shaker plate</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Disposable C-Chip</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 ml and 50 ml</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 and 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson pipettes</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro test tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Assay set-up in the dark</td></tr><tr><td>Black 96-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent plate-reader</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium stubs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tabs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold sputter coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

מחקר לביו-חומרים והנדסת רקמות לעתים קרובות כולל במבחנה חקירות מבוססות תאים, אשר דורשות ידע ראשוני של מספר התאים מתחיל. בעוד חוקרים נפוצים התייחסות צפיפות הזריעה שלהם זה לא בהכרח מצביע על המספר האמיתי של תאים שדבקו בחומר מדובר. הדבר נכון במיוחד במקרה של חומרים, או פיגומים, שאינך מכסים את הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. מחקר זה חוקר את הקובץ המצורף הראשוני של תאי גזע אנושיים mesenchymal זורעים במספר ידוע על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוט לאחר 4 שעות בתרבות. חוטי electrospun הוחזקו בתוך כמה סט-אפים שונים, כוללים כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9, תרבות מוסיף תא ממוקם בצלחות נמוכות מחייבות היטב וpolytetrafluoroethylene שקתות (PTFE) ממוקמים בתוך צלחות פטרי. שני האחרונים היו נתונים לשני תנאים סטטיים או מיקומו על צלחת שייקר (30 <spastyle = &quot;font-size: -14 פיקסלים; קו-גובה: 28px;&quot; n&gt; סל&quot;ד). לאחר דגירה 4 שעות ב 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2, המיקום של תאים שנזרעו נקבע על ידי assay DNA תא. פיגומים הוסרו מאריזותיהם והניחו במאגר תמוגה. חלק התקשורת הוסר באופן דומה וcentrifuged - supernatant מושלך וגלול נפרד מאגר תמוגה. תמוגה חיץ נוסף לכל כלי קיבול, או גם, וגרד לשחרר את כל תאים שעלולות להיות נוכח. Assay DNA התא נקבע אחוז התאים הנוכחיים בתוך הפיגום, התקשורת והשברים היטב. קובץ מצורף תא היה נמוך לכל הסט-אפ ניסיוני, עם קובץ מצורף הגדול ביותר (30%) לחוטים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לרועדים תנועה. מחקר זה מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים הקשורים בפיגומים בלי קשר לצפיפות זריעת תא המוצהרת.

התוצאות מדגישות את מיקומם של התאים הבאים שלאחר זריעה 4 שעות לכל ניסיוני הגדרה נחקרו. איור 2 א ממחיש את אחוז התאים שמחוברים אל פני השטח הפיגום בתקופה זו. גורם המרה של 8.5 pg / תא משמש להמרת תוכן DNA נמדד במספר תא ובכך לקבוע את אחוז התאים 10. לכל להגדיר קופצים הזריעה נחקר, אחוז המצורף תא הוא נמוך יחסית, עם דבקות הגדולה תא (30%) לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל&quot;ד (הכנס אכר). הדבקות הנמוכה ביותר (15%) הייתה לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא וכל זמן תחת תנאים סטטיים (הכנס סטטי). מספר גדול של תאים נכחו בתוך שבריר התקשורת (איור 2), בעיקר לתרבות מוסיף תא שנערך בתוך צלחות נמוכות מחייבות (הכנס סטטי) וכלי סיבוביים להיות 50% ו- 51%בהתאמה. פיגומים שנערכו בתוך השקתות הפגינו מספר גדל מתאים קיימים בתוך המחזיק עצמו - 48% מתאים לשוקת שאכר ו -50% לשוקת סטטי. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אפשר הערכה חזותית של פיגומי תא-זרע (איור 3). נציג תמונות מודגשות נוכחות מוגבלת של תאים על פני השטח הסיביים, ללא קשר לזריעת הגדרה. עם זאת, מספר גדול יותר של תאים והתא agglomerates נכחו על הפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל&quot;ד (הכנס אכר). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> איור 1. ניסיוני סט-אפ, שבו electrospun חוט מוחזק במסגרת; (א) מוסיף תרבית תאים וצלחת גם מחייב נמוך; פולי (B) (tetrafluoroethylene) שוקת (PTFE) וצלחת פטרי; ו(ג) כלי bioreactor. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> מיקום 2. איור של תאים 4 שעות Post-זריעה על PCL electrospun חוטים באמצעות הגדר קופצים זריעה שונה. () מדגים את אחוז התאים שצורפו לפיגום PCL (ממוצע ± סטיית תקן); (ב) מדגיש את התפשטות אחוז מיקום תא בתוך שלושה שברים - תקשורת, גם ופיגום (n = 4, הנתונים שהוצגו כ אומר ערכים). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. הנציגים micrographs אלקטרונים סורק עבור PCL חוטים electrospun עם תאי גזע mesenchymal האדם, 4 שעות לאחר זריעה ראשונית באמצעות ניסיוני סט-אפים שונים. (כל התמונות בהגדלה 1,000X, סרגל קנה מידה = 130 מיקרומטר.) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃŽÂµ-caprolactone Electrospun Yarns at JoVE.com

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K Views.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Video: Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

יסודות Electrospinning: פתרון אופטימיזציה פרמטרים Apparatus

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Biology

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Controlling Electrospun Polymer Morphology for Tissue Engineering Demonstrated Using hepG2 Cell Line

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of electrospun polymers is regarded as a structural imitation of the extracellular matrix (ECM). Hence, electrospun fibers fabricated from biocompatible polymers have been widely investigated by tissue engineering researchers for their potential role as an artificial ECM for guiding tissue growth both in vitro and in vivo. All cells are acutely sensitive to their mechanical environment. This has been demonstrated by the discovery of multiple mechanotransduction pathways intrinsically linked to the cytoskeletal actin filaments. The cytoskeleton acts as a mechanical sensor that can direct the functionality and differentiation of the host cell depending on the stiffness and morphology of its substrate. Electrospun fibers can be tuned both in terms of fiber size and morphology to easily modulate the mechanical environment within a fibrous polymer scaffold. Here, methods for electrospinning polycaprolactone (PCL) for three distinct morphologies at two different fiber diameters are described. The morphological fiber categories consist of randomly oriented fibers, aligned fibers, and porous cryogenically spun fibers, with 1 &#181;m and 5 &#181;m diameters. The methods detailed within this study are proposed as a platform for investigating the effect of electrospun fiber architecture on tissue generation. Understanding these effects will allow researchers to optimize the mechanical properties of electrospun fibers and demonstrate the potential of this technology more thoroughly.

This method provides the means to test different polycaprolactone fiber morphologies and topographies for the purpose of tissue engineering. Small and large fibers are fabricated with random orientations, aligned orientations, and also porous cryogenically electrospun structures and used as platforms for cell culture.