Name: hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system
Uploaded: 2020-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System at JoVE.com

מחקר זה נתמך בפרסים של שותפות הכשרת הדוקטורט MRC (MR/K501293/1), פלטפורמת הרפואה המתחדשת בבריטניה (MRC MR/L022974/1 ו- MR/K026666/1), משרד המדען הראשי (TCS/16/37).

1. תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) על למינין-521
<ol><li>לשמור על תאים פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs) ב 37 °C (5% CO2 בצלחת 6 באר על למינין-521 (LN-521). להאכיל את התאים מדי יום עם 2 מ"ל של אמצעי תחזוקת תאי גזע (כלומר, mTeSR1 בינוני) לכל באר של צלחת 6 טוב עד יום הזריעה שנבחר לבידול (יום 0).</li>
	<li>ודא כי המפגש התא הרצוי של 70-80% מושגת לפני קצירת התא.</li>
</ol>2. למינין-521 הכנה רב-וולית וזריעת hPSC לבידול
הערה: עבור hPSCs לא נשמר על LN-521 (למשל, מטריג'ל או פיברונקטין), לפצל hPSCs על LN-521 ותרבות במשך שבוע אחד לפני עובר ועורר בידול כדי לשפר את היעילות של התהליך15,17,18.
<ol><li>הכנת צלחת מצופה למין<ol>
<li>להפשיר מקטורינה של LN-521 רקומביננטי (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב 4 °C (75 °F) עבור 2 שעות או לילה.</li>
		<li>הכן פתרון 8 מיקרוגרם / מ"ל על ידי דילול LN-521 מופשר בקרח קר 1x DPBS עם Ca2 +/ Mg2 +.</li>
		<li>הוסף 0.25 מ"ל של פתרון LN-521 8 מיקרוגרם / מ"ל לכל באר של צלחת 24 היטב או 0.05 מ"ל לכל באר של צלחת 96 היטב. מנענעים את הצלחת בעדינות מצד לצד כדי לכסות באופן שווה את הבארות בתמיסת LN-521. הערה: עבור תבנית צלחת 96 היטב, חלוקת נפח, זריעת תאים ושינויים בינוניים ניתן לבצע באמצעות צינור אוטומטי למחצה. לפרטים ראו מסגר-ריפולס ואח'19.</li>
		<li>אטמו את הצלחות מצופות LN-521 עם סרט חצי שקוף וגמיש וחסנו ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני השימוש. הערה: LN-521 צלחות מצופות ניתן להשתמש עד 2 שבועות כאשר מאוחסן ב 4 °C (70 °F). יש להימנע מכל ייבוש של בארות מצופות למינין.</li>
	</ol></li>
	<li>ביום זריעת התא, לחמם את הלוחות precoated באינקובטור תרבית התא ב 37 °C (30 °F) במשך 30-60 דקות.</li>
	<li>שאף את פתרון LN-521. הערה: יש להימנע ממגע ישיר של השאפתן עם תחתית הבאר כדי למנוע נזק לציפוי LN-521.</li>
	<li>יש לפזר 0.5 מ"ל של מדיום תחזוקת תאי גזע עם מעכב קינאז (ROCK) הקשור ל-10 מיקרומטר(ROCK) Y27632 לכל באר של צלחת 24 באר או 0.05 מ"ל לכל באר של צלחת 96 באר. מניחים את הצלחת באינקובטור עד מוכן לזריעת תאים.</li>
	<li>ביום הזריעה המתוכנן (יום 0) ועם מפגש hPSC בין 70-80%, לסמן כל אזורים של בידול ספונטני בתחתית בארות של צלחת 6 באר. הערה: הבחנה ספונטנית יכולה להיות חזותית על ידי שינוי גס בגודל התא ו /או נוכחות של מורפולוגיות תאים שונות באמצעות מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה.</li>
	<li>שאפו והשליכו את אזורי הבידול המסומנים ואת המדיום המבוזבז מהבארות. לשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של DPBS ללא Ca2 +/ מ"ג2 + בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הוסיפו מ"ל אחד של ריאגנט דיסוציאציה ללא אנזימים (ראו טבלת חומרים)לכל באר ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 8-10 דקות עד שתאים יתנתקו מהצלחת.</li>
	<li>השתמש מגרד תאים כדי לנתק בעדינות את התאים מהבארות. Pipette התוכן של כל באר למעלה ולמטה 2-4x עם פיפטה P1000 כדי להניב מתלה תא אחד. עבור כל קו תא, תאי בריכה מכל בארות התחזוקה לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף כל אחד מרוקן היטב עם 1 מ"ל של אמצעי תחזוקת תאי גזע. הוסף את הכביסות לצינור המתאים המכיל את התאים המאוחסנים מקו התא המתאים.</li>
	<li>עבור כל שורת תא, בצע שלוש ספירות תאים מעשיות בדגימות המאגדות. חשב את ספירת התאים החיים הממוצעת (תאים חיים/מ"ל) עבור כל שורת תא.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות במאגר ב 250 x g במשך 5 דקות ב RT. לשאוף supernatant, ולאחר מכן resuspend את גלולה התא ב 1-3 מ"ל של אמצעי תחזוקת תאי גזע RT, טרי בתוספת עם 10 μM רוק מעכב Y27632.</li>
	<li>עבור כל שורת תא, חשב את מספר התא הדרוש לפי מספר הבארות שהוכנו בשלב 2.4 (ראה טבלה 1). Resuspend מספר התא הנדרש עם תחזוקת תאי גזע מדיום טרי בתוספת עם 10 μM רוק מעכב Y27632.</li>
	<li>הוסף את אמצעי האחסון המחושב לבארות של הלוחות המוכנים והמקודמים מהשלב 2.4 מבלי להסיר את אמצעי האחסון שנוסף קודם לכן. הנפח הכולל לבאר יהיה 1 מ"ל עבור צלחת 24 היטב ו 0.1 מ"ל עבור צלחת 96 היטב. מנענעים בעדינות את הלוחות מצד לצד וקדימה וקדימה וקדימה כדי להבטיח פיזור תאים אחיד בכל הבאר. הערה: התפלגות תאים זוגית על פני הבאר היא המפתח להבטחת זריעת תאים הומוגניים ובידול מוצלח.</li>
	<li>מניחים את הצלחות המוזרעות באינקובטור ומיד מנענעים את הצלחות המוזרעות בעדינות הלוך ושוב ומצד לצד כדי להפיץ באופן שווה את התאים ולשמור על תרביות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.</li>
</ol>3. הבחנה hPSCs אבות בכבד על למינין-521
<ol><li>הכן מדיה עבור אינדוקציה אנדודרם סופית (שלב 1) באמצעות אנדודרם בסל מדיום בתוספת תוספים הנכונים.<ol>
<li>ביום 0, להפשיר את הבקבוק של אנדודרם בזאל מדיום לילה ב 4 °C (5 °F).</li>
		<li>הכן שלב 1 בינוני 1 (לשימוש ביום 1) לפי הצורך.</li>
		<li>הפשרת תוספת MR ותוספת CJ על קרח.</li>
		<li>לדלל תוספת MR ותוספת CJ 1:100 ב אנדודרם בזאל מדיום.</li>
		<li>הכן שלב 1 בינוני 2 לשימוש בימים 2-4 לפי הצורך.</li>
		<li>לדלל תוספת CJ 1:100 ב אנדודרם בזלת מדיום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן מדיה עבור מפרט תא הכבד הבא (שלב 2) בידול באמצעות מדיום פרוגנטור הכבד.<ol>
<li>ביום 4, להפשיר את הבקבוק של האב הקדמון הכבד מדיום לילה ב 4 °C (5 °F). הערה: 1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים סופיים של 100 IU / mL ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) שימש לניסוי זה. אין צורך באנטיביוטיקה; השימוש באנטיביוטיקה הוא על פי שיקול דעת המשתמש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 1 של ההבחנה, להסיר את מדיום תחזוקת תאי גזע בילה עם 10 μM ROCKi Y-27632 בינוני מן בארות ולהחליף עם 0.5 מ"ל של שלב מלא שלב 1 בינוני 1 לבאר של צלחת 24 היטב 0.1 מ"ל לבאר של צלחת 96 טוב.</li>
	<li>בימים 2, 3 ו -4, להסיר את הבינוני בילה להאכיל כל טוב עם 0.5 מ"ל של שלב 1 בינוני 2 לבאר עבור צלחת 24 טוב או 0.1 מ"ל לבאר של צלחת 96 היטב.</li>
	<li>ביום 5, לתקן את בארות לניתוח בידול אנדודרם סופי באמצעות אימונוציטוכימיה. עבור בארות הנותרות, להסיר את בינוני בילה להאכיל כל טוב עם 0.5 מ"ל של בידול פרג הכבד מדיום לבאר עבור צלחת 24 טוב או 0.1 מ"ל לבאר של צלחת 96 היטב. רענן את המדיום שוב בימים 6, 7 ו- 9.</li>
	<li>ביום 10, לקצור בארות לניתוח בידול האב הכבד או להמשיך עם הבחנה תאים דמויי hepatocyte נוסף. הערה: בשלב זה, דגימות תוקנו עם 4% paraformaldehyde (PFA) עבור ניתוח אימונוציטוכימיה או supernatant נאסף עבור ELISA ותאים נאספו לכימות חלבון.</li>
</ol>4. אפיון תרבויות הבידול של אבות הכבד הנוצרות מ- hPSCs על למינין-521
<ol><li>ביום 5, לזהות ביטוי של סמנים ספציפיים אנדודרם סופי באמצעות חיסונים.</li>
	<li>ביום 10, לזהות ביטוי של סמנים ספציפיים לאב הכבד באמצעות חיסונים.</li>
	<li>ביום 10, למדוד הפרשת AFP ו- ALB באמצעות ELISA באמצעות ערכה בהתאם להוראות היצרן ולנרמל לפי חלבון מ"ג כפי שנקבע על ידי בדיקת חלבון חומצה בינצ'ונינית (BCA).</li>
	<li>להעריך את השונות של אבות הכבד של צלחת 96 באר על ידי כימות של אחוז של תאים חיוביים HNF4α לבאר.</li>
</ol>5. אימונוציטוכימיה ורכישת תמונות
<ol><li>בימים 5 ו -10 של הבידול, לשטוף תאים 3x עם 1x DPBS, עם 0.5 מ"ל לבאר של צלחת 24 היטב ו 0.1 מ"ל לבאר של צלחת 96 היטב. לדגור על הצלחת עם רועד עדין במשך 2-5 דקות ב RT. הערה: השתמש ב- DPSB ללא Ca2+/ Mg2+ עבור אימונוציטוכימיה.</li>
	<li>תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב RT במשך 15-30 דקות על ידי הוספת 0.3 מ"ל של PFA לבאר עבור צלחת 24 טוב ו 0.1 מ"ל לבאר של צלחת 96 היטב.</li>
	<li>לשטוף 3x עם 1x DPBS כמתואר בשלב 5.1.</li>
	<li>פרמז'יליזם את הממברנה עם PBST באמצעות 0.1% Tween, 1x DPBS ודגרה במשך 20 דקות ב RT על ידי הוספת 0.3 מ"ל של PBST לבאר של צלחת 24 טוב ו 0.1 מ"ל לבאר של צלחת 96 טוב.</li>
	<li>בצע את בלוק החלבון על ידי דגירה של התאים עם 10% BSA ב PBST במשך 1 שעה, הוספת 0.3 מ"ל של BSA לבאר של צלחת 24 היטב ו 0.1 מ"ל של BSA לכל באר של צלחת 96 היטב, רועד בעדינות באמצעות שייקר צלחת.</li>
	<li>לאחר חסימת חלבונים, החלף את תמיסת החסימה בנוגדן הראשי מדולל ב- 1% BSA ב- PBST ודגר ב-4 °C (7%), עם רעידות עדינות למשך הלילה. הערה: אין לשטוף בין גוש חלבון לתוספת נוגדנים.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, לשטוף בארות 3x עם PBST.</li>
	<li>הוסף את הנוגדן המשני ב- 1% BSA ב- PBST. דגירה 1 שעה ב RT בחושך עם רועד עדין.</li>
	<li>לאחר דגירה משנית של נוגדנים, יש לשטוף בארות פי 3 עם DPBS 1x ולחלק כתם הוצ'סט בהתאם להוראות היצרן למשך 10 דקות ב-RT בחושך עם רעד עדין.</li>
	<li>לשטוף 3x עם 1x DPBS. הלוחיות מוכנות כעת להדמיה. הערה: יש לאחסן לוחות במהירות של 4 °C (75°F) בחושך עד להדמיה.</li>
	<li>דמיין את הלוח הרב-וולי באמצעות מיקרוסקופ הדמיה בעל תוכן גבוה לאחר אימונוהיסטוכימיה. רכישת תמונה של מספר תחומי תצוגה מומלצת כדי לקבל ייצוג אמיתי של הבאר. הביטוי של הסמנים השונים הוערך באמצעות ניתוח פילוח תאים באמצעות תוכנה מסחרית(ראה טבלת חומרים ) (איור 1). הערה: פילוח תאים יכול להתבצע גם באמצעות תוכנת קוד פתוח לניתוח תמונה כגון CellProfiler או פיג'י20,21.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Szkolnicka, D., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Advances+in+Generating+Hepatocytes+from+Pluripotent+Stem+Cells+for+Translational+Medicine.">Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).</li><li>Heslop, J. A., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+for+Modeling+Liver+Development+and+Disease.">The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease.</a> Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).</li><li>Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cell+therapy:+is+this+the+end+of+the+beginning.">Liver cell therapy: is this the end of the beginning.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Human+Tissue:+Platforms+to+Evaluate+Drug+Metabolism+and+Safety.">Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 20 (2017).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Developmental Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+and+Fgf+signaling+are+essential+for+liver+specification+in+zebrafish.">Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish.</a> Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).</li><li>DeLaForest, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNF4A+is+essential+for+specification+of+hepatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).</li><li>Baxter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+analyses+show+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+better+mimic+fetal+rather+than+adult+hepatocytes.">Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+but+Not+-332,+-111,+or+-411+Enables+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Self-Renewal+In+Vitro.">Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro.</a> Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 103, 86-100 (2016).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+Production+of+Hepatocyte+Like+Cells+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57995 (2018).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Raven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+act+as+Facultative+Liver+Stem+Cells+during+Impaired+Hepatocyte+Regeneration.">Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration.</a> Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism.">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+High-Fidelity+Hepatotoxicity+Models+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55355 (2017).</li><li>Villarin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Supported+Directed+Differentiation+Reveals+a+Unique+Gene+Signature+Predicting+Stable+Hepatocyte+Performance.">Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li></ol>

דוד חי הוא מייסד שותף ובעל מניות של Stemnovate בע"מ שאר המחברים מאשרים כי אין להם ניגודי עניינים בנושא או בחומרים הנדונים במאמר זה.

הדור של תאי אבות הכבד האנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים בקנה מידה גדול יכול לייצג חלופה מבטיחה לחומר שמקורו בגופות. סטנדרטיזציה של פרוטוקולים ושחזור הם המפתח להבטחת תרגום טכנולוגי והשפעה למחקר ביו-רפואי. כדי לטפל בכך, העבודה הקודמת התמקדה בפיתוח פרוטוקול בידול צעדים מ- hESC ו- iPSCs באמצעות תוספים מוגדרים ומטרישות15,23,24,25,26,27,28. על ידי כך, פנוטיפ hepatocyte ושחזור שופרו, המאפשר את האוטומציה למחצה של תהליך הבידול19. המערכת המוצגת מתחזקת על ידי השילוב שלה עם מדיה של תרבית תאים מחוץ למדף ומערכת בידול הפטוצית.
בעבר, צפיפות תאים pluripotent לפני תחילת פרוטוקול הבידול הודגש כמשתנה מפתח כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית של תאי אבות בכבד26. באמצעות הליך מעודן יותר זה, ניתן ליצור מספר גדול של אבות הכבד שמקורם בתאי גזע באופן צעד באמצעות מגוון של צפיפות תאים מתחילים (טבלה 1). ביום 5, אינדוקציה אנדודרמית מוחלטת אומתה על ידי כתמי Sox17(איור 3). בידול יעיל וחזק לאנדודרם סופי הושג הן עם קווי ESC ו- iPSC שנבדקו, עם יותר מ -80% המבטאות את Sox17 (איור 3). ביום העשירי הציגו אבות כבד מורפולוגיה אחידה דמוית אבן-אבן, וסמני תאי גזע בכבד הועשרו מאוד הן עבור AFP והן עבור HNF4α (>86%, איור 4). באמצעות שילוב של טכנולוגיות ידניות ואוטומטיות למחצה ניתן היה לבצע בידול בפורמטים מרובים של לוחות19.
בצורתו הנוכחית, בידול תאים מתאים לניסויים מבוססי במבחנה. עם זאת, העשרת תאים צפויה להידרש לפני יישום קליני כדי להבטיח כי אוכלוסייה הומוגנית של אבות הכבד מוכנים למסירה.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק לתחום גישה סטנדרטית לייצור אבות בכבד בקנה מידה גדול. עבודה עתידית תתמקד בייצור מדיום חדש לבידול, התבגרות ותחזוקה של HLC הבאים.

מחלת כבד מייצגת אתגר בריאותי עולמי, גרימת כ -2 מיליון מקרי מוות בשנה ברחבי העולם1. למרות שקיימות מספר מערכות מודל לחקר מחלות כבד והתערבות קלינית, השימוש השגרתי במערכות מבוססות תאים מוגבל על ידי חסרונות משמעותיים (לסקירה ראו Szkolnicka et al.2). תרבות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתקדמים (hPSC) ושיטות בידול תאים סומטיים מייצגים טכנולוגיות מבטיחות לפיתוח כלים למחקר ביו-רפואי בסיסי ומקורות מתחדשים של תאים מובחנים למרפאה3,4.
עד כה, פרוטוקולים מרובים לבידול תאים דמויי hepatocyte (HLC) פותחו5,6,7,8. פרוטוקולים אלה מנסים לשחזר היבטים של התפתחות הכבד האנושי באמצעות שילוב של מולקולות קטנות וגורמי גדילה9,10. רוב הפרוטוקולים מורכבים מתהליך בידול צעדים, שבו hPSCs מוכנים אנדודרם סופי, ואחריו מפרט אבות בכבד11,12,13, ומסתיים עם מפרט HLC. HLCs המיוצרים על ידי פרוטוקולים אלה מציגים תערובת של פנוטיפים עובריים ומבוגרים. זה כולל את הביטוי של אלפא fetoprotein (AFP), כגון סמני hepatocyte כגון HNF4α ו אלבומין (ALB), כמו גם יכולת חילוף חומרים סמים14,15,16. בין מעבדות, בידול HLC יכול להשתנות; לכן, יש צורך בפיתוח פרוטוקולים סטנדרטיים. זה יאפשר לחוקרים לייצר וליישם ביעילות HLCs שמקורם בתאי גזע בקנה מידה גדול למחקר בסיסי וקליני.
פותחה מערכת בידול אבות בכבד שניתן ליישם הן על קווי תאי גזע עובריים אנושיים והן על קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים באמצעות הנחיות קלות למעקב. הליך זה מניב אוכלוסיות הומוגניות של אבות בכבד בפורמטים שונים של כלי תרבות, החל מבקבוקי תרבית תאים ועד 96 לוחות באר. להלן הפרוטוקול לייצור אבות הכבד שמקורם בתאי גזע בפורמטים של 24 ו-96 בארות.
צפיפות התא המשמש בפרוטוקול המוצג להלן מצוינת עבור באר אחת של צלחת באר 24 ו - 96 בהתאמה (ראה טבלה 1). מיטוב של מספר התא ההתחלתי נדרש עבור תבניות לוח תרבית התאים השונות וקווי התא. צפיפות התא ההתחלתית המוצעת עבור מיטוב פרוטוקול היא 2 x 105 תאים / ס"מ2. עבור אופטימיזציה צפיפות, מספר צפיפות תאים ניתן לבדוק על ידי הוספת ± 50,000 תאים / ס"מ2 בכל פעם.

<table><tbody><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Ready Flow Reagent</td><td>thermofisher</td><td>R37165</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Endoderm Basal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Hepatic Progenitor Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8452</td><td>1:400 (mouse)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Sox17</td><td>R&amp;amp;D Systems, Inc.</td><td>AF1924</td><td>1:200 (Goat)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus Image Data Storage and Analysis system</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system

מחלת כבד היא בעיה בריאותית עולמית הולכת וגוברת. בעוד השתלת כבד היא מצב יעיל של טיפול, תמותת המטופל גדלה עקב מחסור בזמינות איברים תורם. מחסור באיברים משפיע גם על האספקה השגרתית של הפאטוציטים אנושיים למחקר בסיסי ולקליניקה. לכן, פיתוח מקורות מתחדשים של תאי אב כבד אנושיים הוא רצוי והוא המטרה של מחקר זה. כדי להיות מסוגל ביעילות ליצור ולפרוס אבות כבד אנושי בקנה מידה גדול, מערכת בידול כבד לשחזור פותחה. פרוטוקול זה מסייע לשחזור ניסיוני בין משתמשים במגוון פורמטים של כלי תרבות של תאים ומאפשר הבחנות באמצעות שניהם, קווי תאי גזע עובריים אנושיים ומושרים. אלה הם יתרונות חשובים על פני מערכות בידול נוכחיות שישפרו את המחקר הבסיסי ועשויים לסלול את הדרך לפיתוח מוצרים קליניים.

בידול אב בכבד הן מקווי hESC (H9) והן מקווי hiPSC (P106) בוצעה בהתאם לפרוטוקול הצעד המתואר באיור 2. כאן, תאי גזע פלוריפוטנטים נזרעו כתאים בודדים ללוחות מצופים LN-521 לפני תחילת הבידול. השפעה על תאים היא המפתח לבידול חזק ושחזורי. לאחר שהושגה ההשפעה הנכונה (איור 2),החלה בידול. ביום 5, מפרט אנדודרם סופי הוערך באמצעות ביטוי Sox17. בשני קווי התאים, Sox17 התבטא מאוד עם 80% ± 0.5% ו 87.8% ± 0.5% SEM של תאים חיוביים Sox17 עבור H9 ו P106, בהתאמה (איור 3). ביום העשירי הציגו אבות הכבד מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת(איור 2). בנוסף, מפרט אבות הכבד הוערך עבור HNF4α, AFP, ALB, ו cytokeratin-19(CK19) ביטוי, כמו גם הפרשת חלבון AFP ו- ALB10,15,22 (איור 4). הן תרבויות האבות הכבד H9 והן P106 הביעו סמני הכבד העובריים כגון HNF4α (91% ± 0.5% ו -90% ± 0.2%), AFP (89.7% ± 1.8% ו-86% ± 1.2%), ו-CK19 (78.5% ± 3.2% ו-83.6% ± 1.8%)(איור 4). הפרשת AFP התגלתה ביום 10 בשני קווי התא (32.4 ± 1.6 ו-47.8 ± 5.9 ng/mL/mg/24 h)(איור 5). סינתזת אלבומין נצפתה ברמות נמוכות יותר (30.7% ± 1.8% ו-27.2% ± 1.1%)(איור 4)ולא זוהתה באמצעות ELISA(איור 5).
הפרוטוקול אפשר ייצור סטנדרטי של אבות בכבד מ 24 גם ל 96 לוחות באר. צינור אוטומטי למחצה שימש לייצור 96 לוחות באר של אבות בכבד מקווי תא H9 ו- P106 כפי שתואר בעבר17. השתנות מספר התא ויעילות בידול אבות בכבד הוערכו באמצעות כימות של ביטוי HNF4α. פילוח התאים בוצע לכימות חלבונים באמצעות אימונופלואורסצנטיות באמצעות מכשיר הדמיה בעל תוכן גבוה(איור 1). ביום 10, אבות הכבד לא הראו שונות משמעותית בין שורות עם >94% מהתאים החיוביים ל-HNF4α לבאר עבור H9 ו-97% תאים חיוביים HNF4α עבור P106 (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2.jpg"> איור 1: סקירה כללית של צינור פילוח תאים. (A) באמצעות התמונה המקורית, (B) נעשה שימוש בכתמים גרעיניים עבור פילוח גרעינים. (C)שלב בקרת איכות פילוח גרעיני המבוסס על צורה וגודל בוצע רק כדי לכמת גרעינים מקוטעים בבירור. בעקבותזאת, גרעין מוכתם HNF4α חיובי היו מכמתים. לבסוף,הועסק סף מבוסס עוצמה לזיהוי תאים המביעים HNF4α. ב- C ו- E, גרעינים ירוקים מייצגים תאים נבחרים וגרעין מגנטה מציינים תאים שהושלכו. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2.jpg"> איור 2: בידול אבותבכבד לבין hPSCs. (A)ייצוג סכמטי של פרוטוקול בידול אבות הכבד. (B)תמונות מייצגות המדגישות את השינויים המורפולוגיים במהלך ההבחנה. ביום 0 (D0), hPSCs הציגו monolayer ארוז של תאים. לאחר מכן, hPSCs היו מוכנים אנדודרם סופי ביום 5 (D5). זה היה ואחריו בידול האבות הכבד ביום 10 (D10). אבות הכבד הציגו מורפולוגיה של תאים דמויי אבןמרוצפים . סרגל קנה מידה = 75 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2.jpg"> איור 3: אפיון מפרט אנדודרם סופי. ביום 5, תאים היו מוכתמים עבור Sox17, סמן אנדודרם מוחלט. אחוז התאים החיוביים של Sox17 היה 80 ± 0.5% עבור H9 ו 87.8 ± 0.5% עבור P106. כימות האחוזים התבסס על 10 בארות נפרדות עם 6 שדות תצוגה לבאר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3.jpg"> איור 4: אפיון אבות בכבד. ביום העשירי, אבות הכבד היו מוכתמים בסמני הכבד (A)HNF4α, (B) AFP, ו - (C) ALB. עבור H9, אחוז התאים החיוביים היה 91% ± 0.4%, 89.7% ± 1.8%, ו 30.7% ± 1.8% עבור HNF4α, AFP, ו- ALB, בהתאמה. עבור P106, אחוז התאים החיוביים היה 90% ± 0.2%, 86% +/- 1.2%, ו 27.2% ± 1.1% עבור HNF4α, AFP ו- ALB, בהתאמה. (D)פוטנציאל שושלת כולנגיוציט הוערך באמצעות ביטוי CK19; אבות הכבד שמקורם ב-H9 הביעו 78.5% ± 3.2% תאים חיוביים ל-CK19, בעוד ש-83.6% ± 1.8% מהתאים החיוביים ל-CK19 נצפו אצל אבות הכבד P106. כתמי אימונוגלובולין G (IgG) שימשו כבקרת כתמים. כימות האחוזים התבסס על 10 בארות נפרדות עם 6 שדות תצוגה לבאר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig5.jpg"> איור 5: ניתוח הפרשת חלבון מולדת בכבד. הפרשת אלפא פטופרוטאין (AFP) ואלבובין (ALB) נותחה בתרבויות אבות בכבד ביום 10 ב- H9 ו- P109. הנתונים מייצגים שלושה שכפולים ביולוגיים וסרגלי השגיאה מייצגים את ה- SD. חלבונים מופרשים היו מ 24 h תרבית בינוני כמו ננוגרם של חלבון מופרש לכל mL לכל מ"ג של חלבון, n = 3; ND = לא זוהה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2.jpg"> איור 6: הערכת שונות טובהבצלחת 96. (A)הדמיה של 96 תצוגה צלחת היטב של אבות הכבד נגזר H9 מוכתם עם HNF4α. (B)כימות התאים החיוביים HNF4α. ממוצע מספר התא לבאר בשורות, משישה שדות תצוגה לכל כימות היטב. מספר התא הממוצע על פני הלוח היה 94.81% ± 0.22 SEM HNF4α-חיובי תאים לבאר. לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין בארות. (C)הדמיה של 96 תצוגה צלחת היטב של אבות הכבד נגזר P106 מוכתמים עם HNF4α. (D)כימות של תאים חיוביים HNF4α. מספר התא הממוצע לבארות בשורות, משישה שדות תצוגה לבאר ומכומת. מספר התא הממוצע על פני הלוח היה 97.7% ± 0.57 SEM HNF4α-חיובי תאים לבאר. לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שורות. ובכן H12 שימש כשליטה כתמים אימונוגלובולין G (IgG). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. ANOVA בכיוון אחד עם המבחנים הסטטיסטיים שלאחר הוק של טוקי הועסקו. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>תבנית לוח</td>
			<td>שטח פנים (cm2)</td>
			<td>תאים לסמ"ר2</td>
			<td>סה"כ תאים לבאר</td>
			<td>מחלק אמצעי אחסון (מ"ל)</td>
			<td>ריכוז תאים (תאים/מיליליטר)</td>
		</tr>
<tr>
<td>צלחת 24-באר</td>
			<td>1.9</td>
			<td>210526</td>
			<td>400000</td>
			<td>0.5</td>
			<td>800000</td>
		</tr>
<tr>
<td>צלחת 96-באר</td>
			<td>0.32</td>
			<td>187500</td>
			<td>60000</td>
			<td>0.05</td>
			<td>1200000</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: צפיפות תאים מומלצת עבור תבניות הלוח השונות עבור קווי התא hPSC המשמשים בפרוטוקול זה.

Watch this Scientific Journal Video about Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System at JoVE.com

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

מטרת מאמר זה היא לספק גישה סטנדרטית כדי לגרום בידול אב האדם בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים. הפיתוח של הליך זה עם ניסוחים מדיה מוכנים לשימוש מציעים למשתמש מערכת facile כדי ליצור תאי כבד אנושיים למחקר ותרגום ביו-רפואי.

מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

hepatic-progenitor-specification-from-pluripotent-stem-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

4.6K Views.  University of Edinburgh. מטרת מאמר זה היא לספק גישה סטנדרטית כדי לגרום בידול אב האדם בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים. הפיתוח של הליך זה עם ניסוחים מדיה מוכנים לשימוש מציעים למשתמש מערכת facile כדי ליצור תאי כבד אנושיים למחקר ותרגום ביו-רפואי.

Video: Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...