עבודה זו נתמכה פרסים מ של המדען הראשי במשרד (TCS 16 37), מלגת MRC PhD.

1. זריעת תאי גזע Pluripotent (hPSCs) לתוך 96 טוב צלחות עבור Hepatocyte בידול אנושי
הערה: ריאגנטים וציוד המשמשים פרוטוקול זה רשומה בטבלה1. מדיה המשמשת עבור ניסוי זה חייב להיות סטרילי, בטמפרטורת החדר במשך תרבית תאים. כל אמצעי האחסון ריאגנט/הפתרון המתואר בחלק זה של הפרוטוקול מבוססים על טוב יחיד של צלחת 96-ובכן, אלא אם צוין אחרת.
<ol><li>
להכין laminin מצופה לוחות טוב 96.
	<ol>
<li>הפשרת בקבוקון של recombinant laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) עבור 2 h ללון ב 4 º C.</li>
		<li>הכן µg 5/mL פתרון על ידי דילול LN-521 כקרח 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (DPBS) (עם Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>השתמש של נוזל אוטומטי טיפול מתקן עם צינור סטנדרטי dispensing קלטת כדי להוסיף 50 µL של הפתרון LN-521 לכל טוב של צלחת טוב 96. הערה: כל אמצעי האחסון dispenses מבוצעות באמצעות מתקן טיפול בנוזלים אוטומטית עם צינור סטנדרטי dispensing קלטת אלא אם צוין אחרת. פריים הפתרון עד שהוא מגיע לסוף שחולק הקלטת, ולאחר מכן להמשיך לוותר. לוחות מרובים 96-ובכן ניתן להכין על אותו ניסוי על-ידי חזרה על התהליך כמה פעמים לפי הצורך.</li>
		<li>דגירה הלוחות מצופים LN521-37 °C/5% CO2 עבור 2-4 h. הערה: צלחות מצופה LN521 ניתן לאחסן שבועיים, 4 מעלות צלזיוס. שמור את הצלחות חתומות על משטח שטוח כדי למנוע אידוי וזיהום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חממו המספר הנדרש של צלחות מצופה מראש ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי 1 h.</li>
	<li>האחות הפתרון LN-521 הנותרים של המשטח מצופה באמצעות מתאם השאיפה ערוץ 8. הערה: חיוני כדי להימנע מכל מגע עם פני השטח מצופה כדי למנוע השפלה ציפוי.</li>
	<li>מיד להוסיף µL 50 לכל טוב של בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר קינאז הקשורים רו (רוק) מעכב Y27632 ולהשאיר את הצלחת בחממה עד תא זריעה-37 °C/5% CO2. הערה: אל תאפשר את הבארות מצופים laminin להתייבש.</li>
	<li>
להכין השעיה תא של 3 x 105 תאים למ"ל בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632. הערה: צפיפות זריעה עבור כל קו תא ידרוש אופטימיזציה.<ol>
<li>האחות המדיום של צלחת פטרי עם תרבות מובחן של hPSCs כ 75%-85% confluency תרבותי-LN-521 תיאר כאמור12. הערה: hPSCs מתורבתים ב- LN-521 ב mTSER1 עם המדיום השתנה כל 24 שעות, passaged באופן סדיר פעם התאים להגיע 80% confluency כמו שתואר לעיל12.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם 5 מ של טמפרטורת החדר 1 x DPBS (ללא Ca2 +/Mg2 +), לשאוב המאגר.</li>
		<li>הוסף 5 מ של 1 x ריאגנט עדין של דיסוציאציה התא לתאים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 6 עד 8 דקות עבור תא דיסוציאציה. הערה: כדי לעצור את התגובה, לבחון בניתוק של תאים מן המטריצה מתחת למיקרוסקופ. התאים צריך להיות מנותקת חלקית מהצלחת. אם לא, להרחיב את הדגירה למשך דקות תוספת 1 עד 2.</li>
		<li>לסיים את התגובה על ידי כ רפה בעברית הכימית דיסוציאציה תא עדין ולהוסיף 5 מיליליטר בינוני mTeSR1 טרי בתוספת 10 מעכב רוק מיקרומטר Y27632 לתאים. להשתמש במגרדת תא להרים את התאים מטריקס, פיפטה למעלה ולמטה באמצעות טיפ P1000 מספר פעמים כדי לערבב.</li>
		<li>לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer בהתבסס על Trypan Blue מכתים אי-הכללה של שיטת והכן התליה תא עם ריכוזים הנדרש.</li>
		<li>Pipette מספר התאים הרצוי לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי, 15 מ"ל או 50 מ ל, ספין התאים למטה על-ידי צריך שתוציאו אותם ב x 115 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: עבור 96 אחד טוב צלחת, 5 מ של mTeSR1 בינוני המכיל 3 x 105 תאים למ"ל נדרש עבור שורת תאים H9.</li>
		<li>וארוקן את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend בגדר תא עד מתקבל פתרון הומוגני ב 37 מעלות צלזיוס בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632. הערה: השימוש של רוק מעכב מומלצת שכן היא משפרת את התא הישרדות פוסט מחדש ציפוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף µL 50 של התליה תא לצלחת טוב 96 המכיל 50 µL של mTeSR1 עם 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632.</li>
	<li>לאחר זריעה, להחזיר את הצלחות החממה תא-37 °C/5% CO2 במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התאים לצרף.</li>
	<li>לבחון את התאים למחרת ולסגת מעכב רוק לאחר הקימה הקשר מתא לתא. ב- 40% confluency, לעבור התמיינות בינוני (איור 1B). הערה: אם תא confluency גבוהה מ- 40%, הלוחות אינם מתאימים עבור בידול סוללות היבריד עם הקו תא H9.</li>
</ol>2. להבדיל hPSCs לתאי Hepatocyte דמוי רקומביננטי Laminins ב 96 טוב צלחות
<ol><li>
הכינו הבידול גורמים בינוני וצמיחה.
	<ol>
<li>להכין Activin A אנושי מניות פתרון (100 µg/mL) על ידי המסת אבקת Activin A אנושי סטרילי 0.2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1, 000.</li>
		<li>להכין את העכבר Wnt3a מניות פתרון (10 µg/mL) על ידי המסת אבקה Wnt3a העכבר ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:200.</li>
		<li>להכין hepatocyte האנושי גורם הגדילה (דבורה שחר) מניות פתרון (10 µg/mL) על ידי המסת אבקה דבורה שחר האנושי ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1000.</li>
		<li>להכין Oncostatin M (OSM) מניות פתרון (20 µg/mL) על ידי המסת האבקה ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1, 000.</li>
		<li>האנדודרם סופית: להכין האנדודרם בידול בינוני, בהיקף של 2% B27 תוספת (x 50, ללא אינסולין), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי: 100 IU/mL ו- 100 µg/mL, בהתאמה) נוספו רוזוול פארק אנדרטת המכון 1640 ( RPMI 1640) בינוני הבזליים. לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בכל שינוי בינוני, תוספת האחסון הנדרש עם Activin ו Wnt3a-הריכוז הסופי של 100 ננוגרם למ"ל ו 50 ng/mL, בהתאמה.</li>
		<li>בידול Hepatoblast: להכין hepatoblast בידול בינוני, בהיקף של 20% נוקאאוט סרום חלופי (אופנוע), 0.5% חלופה תוספת לגלוטמין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), מ מ 0.1 בטא-mercaptoethanol, דימתיל סולפוקסיד 1% ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU/mL ו- 100 µg/mL, בהתאמה) נוספו נוקאאוט DMEM (KO-DMEM). לסנן תחת ואקום ולאחסן ב 4 º C. השתמש בתוך שבועיים.</li>
		<li>בידול hepatocyte: להכין hepatocyte בידול בינוני, בהיקף של 1% חלופה תוספת לגלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate נתרן מלח (HCC), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU/mL, µg 100/mL, בהתאמה) נוספו HepatoZYME בינונית. לאחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. עבור כל שינוי בינוני, שמשלימה את אמצעי האחסון הדרושים עם דבורה שחר, OSM (ריכוזים הסופי ב 10 ng/mL ו 20 ng/mL, בהתאמה).</li>
	</ol>
</li>
	<li>פוסט 24 שעות זריעה, בזהירות להסיר את המדיום באמצעות מערכת אוטומטית ערוץ אלקטרוניים ידניים פיפטה ולהוסיף µL 100 של מדיום האנדודרם-לקרקע טרי בתוספת 100 ננוגרם למ"ל Activin A ו- 50 ננוגרם למ"ל Wnt3a. הערה: תהליך התמיינות מתחילה ברגע המדיום האנדודרם סופית נוספה. לאחר זריעה התא הוא אופטימלי התמיינות מאותחלת בדרך כלל בתוך 24 שעות. בינוני כל השינויים מתבצעים על ידי הסרת המדיום עם מערכת פיפטה אוטומטי ערוץ אלקטרוניים ידניים, מחלק µL 100 בינוני טריים באמצעות מתקן טיפול בנוזלים אוטומטית עם תקן צינור קלטת שחולק אלא אם אחרת שצוין. מערכת אוטומטית ערוץ אלקטרוניים ידניים פיפטה שימש עם 96 ראש טוב, באמצעות טיפים µL 300. בקצרה, 90 µL היו aspirated מ טוב הימנעות מכל מגע עם תאי, חשוב לא לייבש את התאים במהלך שינוי בינונית להפחתת מתח התא.</li>
	<li>תאי גזע עובריים (hESCs), החליפו המדיום בידול האנדודרם מדי יום למשך שלושה ימים. אם הבידול מבוצע עבור האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), להרחיב את הבמה האנדודרם מוחלטת במשך יומיים נוספים באמצעות רק Activin.</li>
	<li>לאחר אינדוקציה האנדודרם סופית, להחליף אופנוע/דימתיל סולפוקסיד לבינוני עבור מפרט hepatoblast ולאחר שנה המדיום כל יומיים במשך 5 ימים. הערה: אם ישנם מספר של תאים שאינם מצורפים בבאר, השתמש שאינם בתוספת קו-DMEM לרחוץ את התאים פעם אחת לפני השינוי בינוני הבא. בשל משך הזמן של השלב השני של הפרוטוקול (5 ימים), יהיו שינויים בינוני 3 עם האחרון ביום האחרון של מפרט hepatoblast.</li>
	<li>בעקבות הבידול hepatoblast, לעבור HepatoZYME בינונית עבור hepatocyte ההבשלה. לשטוף את התאים פעם אחת עם HepatoZYME ללא תוספת לאחר הסרת אופנוע/דימתיל סולפוקסיד בינונית, להוסיף 100 µL של HepatoZYME בינוניים בתוספת 10 ננוגרם למ"ל דבורה שחר ו 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל 48 שעות 7 עד 10 ימים. -יום 18 של הבידול, לאפיין HLCs על-ידי ניתוח CYP P450 פעילות חילוף החומרים של ביטוי גנים.</li>
</ol>3. אפיון Hepatocyte כמו תאים הבדיל על רקומביננטי Laminins
<ol><li>לאתר את הביטוי של סמנים hepatocyte ספציפיים וסמנים קיטוב באמצעות immunostaining.</li>
	<li>מבחן hepatocyte פונקציה מטבולית באמצעות מבחני CYP P450 כמתואר לפני12.</li>
	<li>לקבוע את הווריאציה צלחת, לספור את המספר הכולל של תאים לכל טוב לכל צלחת.</li>
</ol>4. תפוקה גבוהה Immunocytochemistry ורכישת תמונות
<ol><li>ביום 18 של בידול, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 1 x DPBS, לתקן את HLCs על-ידי שחולק 50 µL של 4% paraformaldehyde (PFA), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר הקיבעון, לשטוף שלוש פעמים עם PBST (0.1% tween) (ללא Ca2 +/Mg2 +) באמצעות דסקית צלחת אוטומטית. הערה: כל שוטף בסעיף זה מבוצעות באמצעות דסקית צלחת אוטומטי אלא אם צוין אחרת. כל שוטף נעשים בעקבות באותו הפרוטוקול.</li>
	<li>Permeabilize את הקרום על ידי שחולק µL 100 של PBST (ללא Ca2 +/Mg2 +), תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לבצע חסימת חלבון מאת שחולק 100 µL של BSA 10% ב- PBST, תקופת דגירה של h 1 לוחצים בעדינות בעזרת מטרף צלחת. לאחר חסימת חלבון, להוסיף 50 µL של 1% BSA PBST המכיל את הנוגדנים העיקרי, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין בעזרת מטרף צלחת. הערה: אנחנו לא שוטפים בין תוספת חלבון בלוק של נוגדן.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, לשטוף שלוש פעמים עם x DPBS 1 (ללא Ca2 +/Mg2 +) ולהוסיף הנוגדן משני על ידי שחולק 50 µL של BSA 1% ב- PBST. דגירה h 1 בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לאחר הדגירה נוגדנים משניים, לשטוף 3 פעמים עם 1 x DPBS. להוסיף 50 µL של DPBS עם דאפי (10 µg/mL) דגירה למשך 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לבסוף, לשטוף 3 פעמים עם DPBS ולהשאיר µL 100 של 1 x DPBS בבאר. לוחות מוכנים עבור הדמיה. הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C בחושך עד הדמיה.</li>
	<li>תמונה את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה גבוהה-תוכן, לרכוש מספר שדות על פני הבאר כדי לקבל ייצוג טוב של הבאר. לכמת את הביטוי סמנים שונים ב- HLCs באמצעות תוכנה קולומבוס (High-תוכן הדמיה ניתוח מערכת תוכנה). הערה: קולומבוס היא תוכנת ניתוח תוכן גבוהה, אשר מציע תא פילוח ןועברל תא phenotyping. תוצאות דומות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש CellProfiler, תוכנה קוד פתוח עבור ניתוח כמותי של תמונות ביולוגי22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Choudhury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+model+pazopanib-mediated+hepatotoxicity.">Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity.</a> Sci Rep. 7, 41238 (2017).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+interindividual+differences+in+hepatic+functions+and+drug+sensitivity+by+using+human+iPS-derived+hepatocytes.">Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+of+hESC/hiPSC-derived+hepatocyte-like+cells+for+drug+toxicity+testing.">3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing.</a> Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Iii, R. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).</li><li>Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+mature+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+an+efficient+three-step+protocol.">Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.</a> Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Self-Renewal+of+Human+ES/iPS-Derived+Hepatoblast-like+Cells+on+Human+Laminin+111-Coated+Dishes.">Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes.</a> Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. , 86-100 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assay+Multiplexing+for+Toxicity+Screening+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+and+Hepatocytes.">High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+images+and+morphological+profiles+of+30,000+small-molecule+treatments+using+the+Cell+Painting+assay.">A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay.</a> GigaScience. , (2017).</li><li>Pradip, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Content+Analysis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+Reveals+Drug+Induced+Steatosis+and+Phospholipidosis.">High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis.</a> Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).</li><li>Donato, M. T., G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Tolosa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high-content+screening+technology+for+studying+drug-induced+hepatotoxicity+in+preclinical+studies.">Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

פרופסור דוד ג חציר הוא מייסד, מנכ ל Stemnovate מוגבלת.
פרופסור דוד ג חציר הוא במאי של HigherSteaks מוגבלת.

הליך חצי אוטומטיות שלנו הוא יעיל, אמין, חסכוני, המאפשר הייצור של HLCs בקנה מידה (איור 1). לא היה כל הבדל משמעותי במונחים של מספר תאים בין הבארות בצלחת, שהופך פלטפורמה זו גישה מתאימה להקרנה מבוססת-תא (איור 2). בנוסף, שזרימת העבודה אוטומציה למחצה מאפשר למשתמש לייצר מספר גדול של צלחות בבת אחת, מה שלא היה אפשרי לפני השימוש תהליכים ידניים5,12.
חשוב, בתהליך אוטומציה לא משפיע על התמיינות התשואות, עם רוב התאים לבטא HNF4α (89.2% ± 2) ואת ALB (92.8% ±6) (איור 3). HLCs גם הביע אנזימי CYP P450 CYP2D6, CYP3A4 ומוצגים CYP1A2 CYP3A מטבולית פעילות דומה דווח על ניסויים (איור 3) הקודם5. למרות התקינה של הפרוטוקול, תא confluency לפני הבידול הוא קריטי עבור בידול סוללות היבריד טהור. לכן, להבטיח התפלגות התא טוב על פני הבאר הוא שיקול חשוב (איור 1). זה הוכיח להיות שורת התאים התלויים, לכן אופטימיזציה זריעה וצפיפות תא נדרש עבור כל לפני קו תא הסולם.
במתכונתה הנוכחית, פלטפורמה זו אינה מתאימה כדי לייצר כמויות גדולות של HLCs עבור יישומים קליניים, זה קרוב לוודאי תושג באמצעות תא מפעלים, ריאקטורים. עם זאת, המתודולוגיה פיתח לאפשר לדור מהירה של תאי הכבד האנושי מחלה דוגמנות, והתרופות הקרנה או סמים שינוי מחקרים. יתר על כן, וזמינותו היא לבצע ריבוב, המתיר את הדור של multiparametric datasets לניתוח מכניסטית. הולך קדימה, אנו גם מאמינים כי טכנולוגיה זו יכול להיות מיושם יותר במבחנה מערכות מורכבות כגון תלת-ממד בידול או כפלטפורמה כדי לשפר את סוללות היבריד פנוטיפ במבחנה.
לסיכום, אנו מאמינים כי המערכת שלנו פשוטים ואוטומטיים למחצה להגדיל את התפוקה ניסיוני, להפחית וריאציה ניסיוני, ובכך שיפור איכות datasets ביולוגי, אקסטרפולציה שלהם כלפי פיזיולוגיה אנושית.

Hepatocytes אנושי ראשוני (PHHs) מייצגים הסטנדרטי העכשווי למחקר ביורפואי בכבד. למרות היתרונות שלהם, PHHs מייצגים מקור מוגבל של hepatocytes בוגרת עם פנוטיפ לא יציב1. תאי גזע עובריים (ESCs), תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSC) הוצעו כמשאב עוצמה למחקר ביורפואי, מבטיח מקור מתחדשת של רקמה אנושית, כולל הכבד2,3,4 . תהליכי התמיינות hepatocyte הנוכחי לייצר תאים המבטאים סמנים hepatocyte, גנים, פונקציות דומות PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. לאחרונה, השימוש בחומרים המוגדרים מטריצות כגון laminins רקומביננטי, יש תא משופרת פנוטיפ הפארמצבטית ניסיוני5,12,13,14.
שיטות חקלאות מסורתית תא יסתמכו על pipetting ידנית, וזה זמן רב וגם מועדת לשגיאות. זה מגביל את התפוקה של וזמינותו ואת התבנית צלחת אחד יכול לעבוד עם. נכון להיום, רוב המחקרים המתארים את הדור של HLCs הם עבודה אינטנסיבית ואופיים, בקנה מידה קטן ולכן גודל15,16,17.
זרם מקדמות טיפול בנוזלים, מערכות pipetting, בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטית מכשירי מעבדה, אפשרו לפתח אשר לצמצם את הדרישה התערבות אנושית. יש לקחת את היתרון של טכנולוגיות אלה, פיתחה מערכת אוטומטית למחצה בידול כדי לייצר כמויות גדולות של רקמת הכבד האנושי לטירונות ואנו חלה המחקר הביו-רפואי. גישה זו יכולה להתבצע עם ESC האנושי והן iPSC קווים עם התאמות קלות הצורך, בהתאם לקו תא. שילוב מערכת זו עם ניתוח תוכן גבוהה, נדגים כי phenotyping סוללות היבריד יכול להיות פחות זמן רב והושמעה בקנה מידה18,19,20,21.
לסיכום, האוטומציה של טכניקות תרבות תא המתוארים בזאת הוביל שיפורים אמינות, ניהול זמן ניסיוני, תפוקה וזמינותו.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips for VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube dispensing cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

גזע pluripotent האנושי מייצגות מקור מתחדשת של רקמה אנושית. המחקר שלנו מתמקדת ביצירת רקמת הכבד האנושי של תאי גזע עובריים (hESCs), המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs). תהליכי התמיינות הנוכחית להפיק תאי hepatocyte דמוי אדם (HLCs) מציג תערובת של תכונות העובר ומבוגרים. כדי לשפר את התא פנוטיפ, מלא הגדרנו את הנהלים הבידול שלנו ואת הגומחה תא, וכתוצאה מכך הדור של אוכלוסיות תאים המציגים ביטוי גנים משופרת ותפקוד. בעוד מחקרים אלה לסמן התקדמות, היכולת להפיק כמויות גדולות של ריבוי הצלחות טוב להקרנה היה מוגבל הליכי עבודה אינטנסיבית, וריאציה אצווה כדי אצווה. כדי להתמודד עם בעיה זו, פיתחנו פלטפורמה חצי אוטומטיים כדי להתמיין זריעה תא HLCs. גזע גזע pluripotent, בידול בוצעו באמצעות טיפול בנוזלים ומערכות pipetting אוטומטי בתבנית 96-ובכן צלחת. בעקבות הבידול, תא פנוטיפ נותחו באמצעות מיקרוסקופ אוטומטיות ו- luminometer טוב של רב.

תאית התמיינות בוצעה באמצעות קו בתאי גזע עובריים (H9). הרציף האוטומטי למחצה נעשה שימוש כדי להבדיל ולאפיין את התאים (איור 1 א'). מתקן אוטומטי טיפול בנוזלים שימשה מעיל מטריקס וזרע תאים בודדים. התמיינות היה יזם כאשר התאים הגיעו 40% confluency (יום 0). שינויים מדיה בוצעו באמצעות מערכת פיפטה אוטומטי ערוץ אלקטרוניים ידניים להסרת בינונית, מנפק טיפול בנוזלים עבור תוספת בינונית (איור 1 א'). קיבוע תא, צביעת בוצעו באמצעות מנפק טיפול אוטומטי נוזלי בשילוב עם צלחת אוטומטית למכונת הכביסה. הדמיה של כימות בוצעו על-ידי שימוש של מערכת הדמיה גבוהה-תוכן ותוכנה קולומבוס. פעילות ציטוכרום P450 נמדדה באמצעות assay הוקמה. בעקבות המצע דגירה, supernatants תא נקטפו, והקליט ביולומינסנציה שימוש בקורא כינוייהם microplate (איור 1 א'). בנוסף, שלב קונבנציונאלי ניגודיות מיקרוסקופ שימש כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה תאים במהלך התמיינות hepatocyte (איור 1B).
ביום 18, נבדקה מידת ההשתנות במספר התאים בין בארות בעקבות דאפי מכתים (איור 2 א). 7 שדות ראייה נלכדו לכל טוב ואת המספר של גרעינים לכמת (איור 2 א). גילינו אין כל הבדל סטטיסטי בין וולס עם ממוצע של 41,662 ±3, תאים 366 לכל טוב (איור 2B).
ביום 18, HLCs היו קבוע צבעונית לסמני אופייני hepatocyte (איור 3A-G), נבדקו עבור פעילות CYP P450. HLCs הביע סמנים hepatocyte כגון HNF4α (89.2% ± 2 חיובי תאים), ALB (תאים חיוביים 92.8% ±6), AFP (61.8% ± 2 תאים חיוביים). HLCs גם לידי ביטוי חלבונים CYP P450, CYP2D6, CYP3A4 ומוצגים מצולע מראה ייחודי כפי שמוצג על ידי E-קדהרין ביטוי חלבון. פעילות CYP P450 HLCs נמדדה ביום 18. HLCs הציג פעילות CYP1A2 ±45 295,906, 828 RLU/mL/mg של חלבון ו- CYP3A-±177 1,066,112, 416 RLU/mL/mg של חלבון (איור 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> איור 1: בידול Hepatocyte החל מגירסה בשנת 96 עיצוב טוב. (א). תרשים של הציוד להשתמש למחצה לאוטומטיות התמיינות, קיבוע, מכתים, הדמיה של פעילות פונקציונלית. (B). נציג משתנה ב מורפולוגיה הסלולר במהלך התמיינות סוללות היבריד. בקצרה, מגירסה הם טענתי כלפי האנדודרם סופית, ואחריו hepatoblast מפרט מאופיין על ידי הצגת ריצוף דמוי מורפולוגיה תאים, לפני ההבשלה hepatocyte עם תאים רכישת צורת מצולע. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> איור 2: הערכת ההשתנות טוב-כדי-טוב HLCs. (א) ייצוג 96. ובכן לוח תצוגה של HLCs צבעונית עם דאפי. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (B) כימות של מספר הטלפון הנייד לכל טוב. ממוצע של מספר הטלפון הנייד לכל בארות בעמודות (למעלה) ושורות (למטה), משדות שבעה של תצוגות לכל טוב, כימות באמצעות תוכנה קולומבוס. מספר הטלפון הנייד הממוצע על פני המשטח הוא 41,662 ± 3,366 SEM תאים לכל טוב. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו בין בארות. ANOVA One-way עם בדיקות סטטיסטיות של פוסט-הוק של Tukey הועסק. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> איור 3: מדידת פעילות CYP P450 ב HLCs ביום 18 וביטוי של סמן Hepatocyte. (א) האחוז של אלפא גרעיני גורם 4 hepatocyte (HNF4α) ביטוי ± SEM מבוסס על בארות שלושים עם 10 שדות ראייה לכל טוב. (B) האחוז של אלבומין (ALB) ביטוי + /-SEM, מבוסס על 3 בארות נפרד עם 10 שדות ראייה לכל טוב. (ג) אחוזי fetoprotein אלפא (AFP) + /-SEM מבוסס על 3 בארות נפרד עם 10 שדות ראייה לכל טוב. (ד) E-קדהרין מכתים. (ה) CYP2D6 מכתים. (נ) CYP3A4 מכתים. (G)-אימונוגלובולין G (IgG) צביעת שליטה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (H) CYP P450 1A2 ו- 3A פעילות חילוף החומרים ב- HLCs ב- 18 יום. מייצג הנתונים ביולוגית שישה משכפל + /-פעילות ב- SEM. מצוטט כאומר יחידות קלות יחסית (RLUs) /mL לכל 1 מ ג חלבון. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר גישה אוטומטית למחצה כדי לייצר hepatocyte כמו תאים מתאי גזע pluripotent אנושי בתבנית 96 צלחת טוב. תהליך זה הוא מהירה וחסכונית, המאפשר שהייצור של איכות מובטחת אצוות של תאים hepatocyte דמוי למחקר אנושי בסיסי ויישומי.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

semi-automated-production-hepatocyte-like-cells-from-pluripotent-stem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Views.  University of Edinburgh. פרוטוקול זה מתאר גישה אוטומטית למחצה כדי לייצר hepatocyte כמו תאים מתאי גזע pluripotent אנושי בתבנית 96 צלחת טוב. תהליך זה הוא מהירה וחסכונית, המאפשר שהייצור של איכות מובטחת אצוות של תאים hepatocyte דמוי למחקר אנושי בסיסי ויישומי.

Video: Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biology

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

פרוטוקול אינטגרטיבי ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים בכבד אנושי שמקורם ב-iPSC

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Bioengineering

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Immunology and Infection

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...