이 연구는 MRC 박사 훈련 파트너십 (MR /K501293/1), 영국 재생 의학 플랫폼 (MRC MR /L022974/1 및 MR/K02666/1), 수석 과학자 사무소 (TCS/16/37)의 수상으로 지원되었습니다.

1. 라미닌-521에 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 유지 보수
<ol><li>인간 다능성 세포(hPSC)를 라미닌-521(LN-521)에 6웰 플레이트에서 37°C 및 5%CO2로 유지한다. 줄기세포 유지보수 배지(즉, mTeSR1 배지)의 2mL로 매일 세포를 공급하여 6웰 플레이트당 분화를 위해 선택한 종자일(일 0)까지 공급한다.</li>
	<li>세포 수확 전에 70-80%의 원하는 세포 합류가 달성되는지 확인하십시오.</li>
</ol>2. 라민-521 멀티웰 준비 및 차별화를 위한 hPSC 시드
참고: HPSC의 경우 LN-521(예를 들어, 마트리겔 또는 섬유네틴)에 유지되지 않는 hPSC를 LN-521및 문화로 분할하여 1주 동안 의공정의효율을 향상시키기 위해 월화 및 분화를 유도한다15,17,18.
<ol><li>라미닌 코팅 플레이트 준비<ol>
<li>재조합 LN-521(100 μg/mL)의 바이알을 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 해동한다.</li>
		<li>Ca2+/Mg2 +얼음 차가운 1x DPBS에서 해동 된 LN-521을 희석하여 8 μg / mL 솔루션을 준비하십시오.</li>
		<li>8 μg/mL LN-521 용액의 0.25mL을 24웰 플레이트 또는 0.05 mL의 각 웰에 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. LN-521 용액으로 접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 우물을 고르게 코팅합니다. 참고: 96웰 플레이트 형식의 경우, 반자동 파이프라인을 사용하여 볼륨 디스펜싱, 셀 파싱 및 중간 변화를 수행할 수 있습니다. 자세한 내용은 메세게르 리폴스 외19를참조하십시오.</li>
		<li>LN-521 코팅 플레이트를 반투명하고 유연한 필름으로 밀봉하고 사용하기 전에 밤새 4 °C에 보관하십시오. 참고: LN-521 코팅 플레이트는 4°C에 보관할 때 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 라미닌 코팅 된 우물의 건조를 피하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 파종 당일, 30-60분 동안 37°C에서 세포 배양 배양에서 미리 코팅된 플레이트를 예열한다.</li>
	<li>LN-521 솔루션을 흡인합니다. 참고: LN-521 코팅의 손상을 방지하기 위해 우물 바닥과 흡인기의 직접적인 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>줄기세포 유지보수 배지0.5mL을 새로 보충하여 10μM Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y27632를 각각 24웰 플레이트 또는 0.05mL의 각 웰에 96웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 세포 시드를 준비할 때까지 접시를 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>예정된 시드일(0일)과 70~80%의 hPSC 합류로, 6웰 플레이트의 우물 바닥에 자발적인 분화 부위를 표시한다. 참고: 자연분화는 위상 조영 현미경을 사용하여 세포 크기 및/또는 상이 다른 세포 형태학의 존재에 있는 총 변화에 의해 시각화될 수 있습니다.</li>
	<li>흡인 및 차별화의 표시된 영역과 우물에서 소비 된 매체를 폐기합니다. 실온(RT)에서 Ca2+/Mg2+ 없이 DPBS 1mL로 각각 잘 씻으십시오.</li>
	<li>효소가 없는 해리 시약 1mL(재료 표참조)를 각 우물에 넣고 37°C에서 8-10분 동안 배양하여 세포가 플레이트에서 눈에 띄게 분리될 때까지 배양합니다.</li>
	<li>셀 스크레이퍼를 사용하여 우물에서 세포를 부드럽게 분리합니다. P1000 파이펫으로 각 웰의 내용내용이 2-4배 위아래로 피펫되어 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 각 세포주에 대해, 모든 유지 보수 우물에서 멸균 50 mL 튜브로 풀 셀.</li>
	<li>줄기 세포 유지 보수 매체의 1 mL로 비워 각 세척. 적절한 세포주로부터 풀링된 세포를 포함하는 해당 튜브에 세체를 추가합니다.</li>
	<li>각 세포주에 대해 풀로 풀린 샘플에서 3개의 실행 가능한 셀 카운트를 수행합니다. 각 세포주에 대한 평균 라이브 셀 수(라이브 셀/mL)를 계산합니다.</li>
	<li>원심분리기는 RT에서 5분 동안 250 x g의 풀이 된 샘플을 흡인한 다음, 10 μM ROCK 억제제 Y27632로 새롭게 보충된 RT 줄기 세포 유지 보수 매체의 1-3mL에서 세포 펠릿을 재연합니다.</li>
	<li>각 세포주에 대해, 2.4 단계에서 준비된 우물수당 필요한 셀 수를 계산한다(표 1참조). 10 μM ROCK 억제제 Y27632로 새롭게 보충된 줄기 세포 유지 보수 매체로 필요한 세포 번호를 다시 중단합니다.</li>
	<li>이전에 추가된 볼륨을 제거하지 않고 2.4 단계에서 준비된 미리 코팅된 플레이트의 우물에 계산된 볼륨(들)을 추가합니다. 웰당 총 부피는 24웰 플레이트의 경우 1mL, 96웰 플레이트의 경우 0.1mL입니다. 접시를 좌우로 앞뒤로 부드럽게 흔들어 우물 전체에 세포 분산도 보장합니다. 참고: 우물 을 가로지르는 균등한 세포 분포는 균질성 세포 파종과 성공적인 분화를 보장하는 열쇠입니다.</li>
	<li>시드 플레이트를 인큐베이터에 넣고 시드 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 세포를 균등하게 분배하고 37°C 및 5% CO2에서배양을 유지한다.</li>
</ol>3. 라미닌-521에 간 선조에 hPSC를 차별화
<ol><li>올바른 첨가물로 보충된 Endoderm 기저매체를 사용하여 최종 엔도름 유도(1단계)를 위한 미디어를 준비한다.<ol>
<li>0일째에는 엔도름 기저형의 병을 4°C에서 하룻밤 동안 해동한다.</li>
		<li>필요에 따라 1단계 중간 1단계(1일째 에 사용)를 준비합니다.</li>
		<li>해동 보충 MR 및 얼음에 보충 CJ.</li>
		<li>희석 보충 MR 및 보충 CJ 1:100 엔도름 기초 매체에.</li>
		<li>필요에 따라 2-4일에 사용할 수 있는 1단계 중간 2단계를 준비합니다.</li>
		<li>희석 보충 CJ 1:100 엔도름 기초 매체에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후속 간 선조 세포 사양(2단계) 분화를 위한 배지를 준비하여 간 선조 배지를 이용하여 한다.<ol>
<li>4일째에는 4°C에서 하룻밤 사이에 선조중의 병을 해동한다. 참고: 1% 페니실린/연쇄절제술(IU/mL 100μg/mL의 최종 농도)이 이 실험에 사용되었다. 항생제는 필요하지 않습니다; 항생제 사용은 사용자 재량에 따라 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분화 첫날, 웰에서 10 μM ROCKi Y-27632 배지로 소비된 줄기세포 유지 보수 매체를 제거하고, 웰당 24개의 웰 플레이트당 0.5mL, 96웰 플레이트당 0.1mL로 대체한다.</li>
	<li>2일, 3일, 4일에는, 소비된 매체를 제거하고 96웰 플레이트당 24웰 플레이트 또는 0.1mL당 잘 1단계 중간 2의 0.5mL로 각각 잘 공급한다.</li>
	<li>5일째에, 면역 세포화학을 통한 최종 내분분 분석에 대한 우물을 수정한다. 나머지 우물의 경우, 소비된 배지를 제거하고 각각 0.5mL의 간 선조 분화 배지를 잘 공급하여 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트당 0.1mL에 대해 잘 한다. 6일, 7일, 9일에 다시 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>10일째에, 간 선조 분화 분석을 위한 우물을 수확하거나 추가 간세포 와 같은 세포 분화를 진행한다. 참고: 이 시점에서, 시료는 면역세포화학 분석을 위한 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정되거나, 엘리사및 세포를 위해 수집된 수퍼나일제는 단백질 정량화를 위해 수집되었다.</li>
</ol>4. 라미닌-521에 hPSC에서 생성된 간 선조 분화 배양의 특성화
<ol><li>5일째에 면역스테인링을 사용하여 최종 엔도름 특이적 마커의 발현을 감지합니다.</li>
	<li>10일째에 면역염색을 사용하여 간 선조 특이적 마커의 발현을 감지한다.</li>
	<li>10일, 제조사의 지시에 따른 키트를 사용하여 ELISA를 통한 AFP 및 ALB 분비를 측정하고, 비신천산(BCA) 단백질 분석서에 의해 결정된 대로 mg 단백질당 정상화한다.</li>
	<li>잘 결합된 HNF4α 양성세포의 백분율을 정량화하여 96웰 플레이트의 간 전구 가변성을 평가한다.</li>
</ol>5. 면역 세포 화학 및 이미지 수집
<ol><li>5일과 10일, 1x DPBS로 3배, 웰당 0.5mL, 웰당 0.1mL로 96웰 플레이트. RT에서 2-5 분 동안 부드러운 흔들림으로 접시를 배양하십시오. 참고: 면역 세포화학에 대해 Ca2+/Mg2+ 없이 DPSB를 사용하십시오.</li>
	<li>15-30분 동안 RT에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정하여 우물당 0.3mL의 PFA를 24웰 플레이트에 추가하고 96웰 플레이트당 0.1mL를 첨가한다.</li>
	<li>5.1 단계에서 설명한 대로 1x DPBS로 3배 세척합니다.</li>
	<li>PBST로 멤브레인을 0.1% Tween, 1x DPBS를 사용하여 멤브레인을 20분 동안 배양하고, 96웰 플레이트당 24개의 웰 플레이트당 PBST0.3mL, 0.1mL를 추가하여 RT에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 PBST에서 10% BSA로 세포를 배양하고, 우물당 0.3mL의 BSA를 추가하고 96웰 플레이트당 BSA의 0.1mL을 추가하여 플레이트 셰이커를 사용하여 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>단백질 차단 후, 차단 용액을 PBST에서 1% BSA로 희석된 1차 항체로 대체하고 4°C에서 하룻밤 동안 부드러운 흔들림으로 배양한다. 참고: 단백질 블록과 항체 첨가 사이에 세척하지 마십시오.</li>
	<li>24 시간 후, PBST와 함께 3 배 우물을 씻으라.</li>
	<li>PBST에서 1% BSA에 이차 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 RT에서 1 h를 배양하십시오.</li>
	<li>이차 항체 인큐베이션 후, 1x DPBS로 우물 3배를 씻고, 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 제조업체의 지시에 따라 Hoechst 얼룩을 분배하십시오.</li>
	<li>1x DPBS로 3배 세척합니다. 플레이트는 이제 이미징을 할 준비가 되었습니다. 참고: 이미징까지 어두운 4°C에 접시를 저장합니다.</li>
	<li>면역 조직 화학 후 고함량 이미징 현미경을 사용하여 다중웰 플레이트를 이미지합니다. 여러 뷰 필드의 이미지 수집은 우물의 진정한 표현을 얻는 것이 좋습니다. 상이한 마커의 발현은 상용 소프트웨어를 이용한 세포 세분화 분석을 통해 평가하였다(재료표참조)(도 1). 참고: 셀 프로파일러 또는 피지20,21과같은 이미지 분석 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 셀 세분화도 수행할 수 있다.</li>
</ol>

<ol>
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데이비드 C. 헤이는 스템노바테 주식회사의 공동 창립자이자 주주입니다. 나머지 저자는 이 문서에서 논의된 주제나 자료에 대한 이해상충이 없음을 증명합니다.

대규모로 만능 줄기 세포로부터 인간 간 전구 세포의 생성은 시체 유래 물질에 대한 유망한 대안을 나타낼 수 있습니다. 프로토콜 표준화 및 재현성은 생체 의학 연구에 대한 기술 번역 및 영향을 보장하는 데 핵심적입니다. 이를 해결하기 위해, 이전 작품은 정의된 첨가제 및 매트릭스 15,23,24,25,26,27,28을사용하여 hESC 및 iPSC로부터 단계적 차별화 프로토콜을 개발하는 데주력하고 있다. 이를 통해, 간세포 표현형 및 재현성이 개선되어 분화공정(19)의반자동화를 허용한다. 제시된 시스템은 기성 세포 배양 매체 및 촉진 간세포 분화 시스템과의 조합으로 강화됩니다.
이전에는 분화 프로토콜이 시작되기 전에 만능 세포 밀도가 간 선조 세포의 균질한 집단을 달성하기 위한 핵심 변수로강조되었다(26). 이러한 보다 정제된 절차를 이용하여, 다양한 세포밀도(표 1)를이용하여 단계적으로 줄기세포 유래 간 전구체를 단계적으로 생성할 수 있다. 5일째, 최종 엔도름 유도는 Sox17염색(도 3)에의해 검증되었다. 최종 엔도름으로 효율적이고 견고한 분화는 테스트된 ESC 및 iPSC 라인 모두에서 달성되었으며, 80% 이상이 Sox17(그림3)을발현했습니다. 10일째에, 간 선조들은 균일한 조약돌 같이 형태를 보였고, 간 줄기세포 마커는 AFP와 HNF4α(>86%, 도 4)에대해 높게 농축되었다. 수동 및 반자동 기술의 조합을 사용하여 다중 플레이트포맷(19)에서차별화를 수행할 수 있었다.
현재 의 형태로, 세포 분화는 시험관 내 실험에 적합합니다. 그러나, 세포 농축은 간 선조의 균질한 인구가 납품을 위해 준비된다는 것을 확인하기 위하여 임상 신청 의 앞에 요구될 것입니다.
결론적으로, 여기서 설명된 프로토콜은 대규모로 간 선조를 생성하는 표준화된 접근법을 필드에 제공한다. 향후 작업은 후속 HLC 차별화, 성숙 및 유지 보수를 위한 새로운 매체의 생산에 초점을 맞출 것입니다.

간 질환은 전 세계적으로 연간 약 2백만 명의 사망을 초래하는 글로벌 건강 문제를 나타냅니다1. 많은 모델 시스템이 간 질환을 연구하고 임상적으로 개입하기 위해 존재하지만, 세포 기반 시스템의 일상적인 사용은 상당한 단점에 의해 제한됩니다 (검토를 위해 Szkolnicka 외.2참조). 첨단 인간 다능성 줄기세포(hPSC) 배양 및 체세포 분화 방법은 클리닉3,4를위한 분화세포의 기본 생체 의학 연구 및 재생 가능한 공급원을 위한 도구를 개발하는 유망한 기술을 나타낸다.
현재까지, 간세포형 세포(HLC)를 위한 다중 프로토콜이 개발되었다5,6,7,8. 이러한 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자의 조합을 사용하여 인간 간 발달의 측면을 재현하려고9,10. 대부분의 프로토콜은 hPSC가 최종 종말에 준비되어 있는 단계별 분화 과정으로 구성되며, 그 다음으로 간 선조 사양11,12,13,HLC 사양으로 끝납니다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 HLCs는 태아와 성인용 표현형의 혼합물을 표시합니다. 여기에는 HNF4α 및 알부민(ALB)과 같은 간세포 마커와 같은 알파 페토프로틴(AFP)의 발현뿐만 아니라 약물 대사용량(14,15,16)이 포함됩니다. 실험실 간에 HLC 분화는 다를 수 있습니다. 따라서 표준화된 프로토콜의 개발이 필요합니다. 이를 통해 연구자들은 기본 및 임상 연구를 위해 줄기 세포 에서 파생된 HLC를 대규모로 효과적으로 생성하고 적용할 수 있습니다.
간 선구분화 시스템은 따르기 쉬운 지침을 사용하여 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주 모두에 적용될 수 있는 개발되었다. 이 절차는 세포 배양 플라스크에서 96 개의 웰 플레이트에 이르기까지 다양한 배양기 형식으로 간 선조의 균질한 인구를 산출합니다. 아래 제공된 프로토콜은 줄기 세포 유래 간 선조를 24 및 96 웰 포맷으로 생산하는 프로토콜이다.
아래에 제시된 프로토콜에 사용되는 세포 밀도는 각각 24 및 96 웰 플레이트의 한 웰에 대해 지정됩니다(표 1참조). 상이한 세포 배양 플레이트 포맷 및 세포주에 대해 시작 세포 수의 최적화가 요구된다. 프로토콜 최적화를 위한 제안된 시작 세포 밀도는 2 x 105 세포/cm2이다. 밀도 최적화를 위해, 한 번에 50,000개의 세포/cm2를 ± 추가하여 여러 세포 밀도를 테스트할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14040133</td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342 Ready Flow Reagent</td>
			<td style="width:171px;">thermofisher</td>
			<td>R37165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Endoderm Basal Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Hepatic Progenitor Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Antibodies</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td style="width:107px;">1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td style="width:107px;">1:400 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">IgG</td>
			<td style="width:171px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sox17</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1:200 (Goat)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">Columbus Image Data Storage and Analysis system</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system

간 질환은 증가하는 글로벌 건강 문제입니다. 간 이식은 치료의 효과적인 모드인 동안, 기증자 기관 가용성에 있는 부족으로 인해 환자 사망률이 증가했습니다. 장기 부족은 또한 기본적인 연구 및 진료소를 위한 인간 간세포의 일상적인 공급에 영향을 미칩니다. 따라서 인간 간 전구 세포의 재생 가능한 소스의 개발이 바람직하며이 연구의 목표입니다. 인간 간 전구를 대규모로 효과적으로 생성및 배치할 수 있도록, 재현가능한 간 선조 분화 시스템이 개발되었다. 이 프로토콜은 다양한 세포 배양기 형식의 사용자 간의 실험 재현성을 돕고 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주를 사용하여 분화를 허용합니다. 이들은 기본적인 연구를 강화하고 임상 제품 개발을 향해 길을 열 수 있습니다 현재 분화 시스템에 비해 중요한 장점이다.

hESC(H9) 및 hiPSC(P106) 라인에서 간 선조 분화는 도 2에기재된 단계별 프로토콜에 따라 수행되었다. 여기서, 만능 줄기 세포는 분화의 개시 전에 LN-521 코팅 판으로 단하나 세포로 종자하였다. 세포 합류는 견고하고 재현 가능한 분화를 위한 핵심입니다. 일단 올바른 합류가 달성되면(그림 2),차별화가 시작되었다. 5일째에, 최종 엔도름 사양은 Sox17 발현을 통해 평가되었다. 두 세포주에서 Sox17은 H9 및 P106에 대해 Sox17 양성 세포의 0.5%± 0.5%와 87.8%로 각각 80%± 높게나타났다(그림 3). 10일째에, 간 선조는 조약돌 같이 모양체를 표시했습니다(그림 2). 또한, 간 선조 사양은 HNF4α, AFP, ALB 및 사이토케라틴-19(CK19) 발현뿐만 아니라 AFP 및 ALB 단백질 분비10,15,22(도 4)에대해 평가되었다. H9과 P106 간 배구모두 HNF4α(91% ± 0.5%, ± 0.2%), AFP(89.7% ± 1.8%, ± 1.2%), CK19(78.5%± 3.2%, 83.6%)±.8%)과 같은 태아간 마커를나타냈다. AFP 분비액은 10일째 에 두 세포주(32.4± 1.6 및 47.8 ± 5.9 ng/mL/mg/24h)에서 검출되었다(그림5). 알부민 합성은 낮은 수준(30.7% ± 1.8%, 27.2% ± 1.1%)으로 관찰되었으며ELISA(그림4)를통해 검출되지 않았다.
이 프로토콜은 24웰에서 96개의 웰 플레이트까지 간 선조의 표준화된 생산을 허용했습니다. 반자동 파이프라인은 H9 및 P106 세포주로부터 96개의 잘 플레이트를 생산하기 위해 이전에 설명된17과같이 사용되었다. 세포 수 가변성 및 간 선조 분화 효율은 HNF4α 발현의 정량화를 통해 평가되었다. 세포 세분화는 고함량 이미징기기(도 1)를이용하여 면역형광을 통한 단백질 정량화를 위해 수행되었다. 10일째에, 간 선조들은 H9에 대해 HNF4α 양성세포의 94% >94%, P106에 대한 HNF4α 양성세포 97%를 가진 행에 걸쳐 유의한 가변성을 나타내지않았다(그림 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2.jpg"> 도 1: 세포 세분화 파이프라인 개요. (A)원이미지를 사용하여(B)핵 염색이 핵 분할에 사용되었다. (C)형상 및 크기에 기초한 핵 세분화 품질 관리 단계는 명확하게 분할된 핵을 정량화하기 위해 수행되었다. (D)이에 따라 양성 HNF4α-스테인드 핵을 정량화하였다. (E)마지막으로, 강도 기반 임계값은 HNF4α-발현 세포를 식별하기 위해 사용되었다. C와 E에서,녹색 핵은 선택된 세포를 나타내고 마젠타 핵은 버려진 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2.jpg"> 도 2: hPSC로부터의 간 선조 분화. (A)간 선구 분화 프로토콜의 회로도 표현. (B)분화 시 형태학적 변화를 강조하는 대표적인 이미지. 0일째(D0)에서 hPSC는 셀의 포장된 단층층을 제시했습니다. 이에 따라 hPSC는 5일째(D5)에 최종 엔도드름으로 준비되었습니다. 이것은 10일째 (D10)에 간 선조 분화에 선행되었습니다. 간 선조는 조약돌 같은 세포 형태를표시했다. 스케일 바 = 75 μm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2.jpg"> 그림 3: 최종 엔데덤 사양의 특성화. 5일째에, 세포는 Sox17, 결정적인 엔도드름 마커를 위해 염색되었습니다. Sox17 양성 세포의 비율은 80 ± H9에 대 한 0.5% 및 87.8 p106에 대 한 0.5%±. 백분율 정량화는 10개의 개별 우물을 기반으로 하며, 6개의 필드가 잘 볼 수 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM. Scale 막대 = 50 μm로 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2large.jpg" target="_blank">표시됩니다.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3.jpg"> 그림 4: 간 선조 특성. 10일째에, 간 선조들은 간마커(A)HNF4α,(B)AFP 및(C)ALB를 위해 염색되었다. H9의 경우, 양성세포의 비율은 각각 91%, ± 0.4%, 89.7%± 1.8%, 30.7%로 HNF4α, AFP, ALB의 경우 각각 1.8%±. P106의 경우, 양성 세포의 비율은 각각 HNF4α, AFP 및 ALB에 ± 대해 각각 0.2%, 86% +/- 1.2%, 27.2%± 90%였다. (D)Cholangiocyte 계보 잠재력은 CK19 발현을 통해 평가되었다; H9 유래 간 선조는 3.2% CK19 양성 세포를 ± 78.5%를 표현한 반면, 83.6%는 CK19 양성 세포의 ± 1.8%가 P106 간 선조인을 관찰하였다. 면역글로불린 G(IgG) 염색은 염색 제어로서 사용하였다. 백분율 정량화는 10개의 개별 우물을 기반으로 하며, 6개의 필드가 잘 볼 수 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM. Scale 막대 = 50 μm로 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3large.jpg" target="_blank">표시됩니다.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig5.jpg"> 그림 5: 간 선조 단백질 분비 분석. 알파 페토프로틴(AFP)과 알부민(ALB)의 분비액은 H9과 P109에서 10일째에 간 선조 배양에서 분석되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제를 나타내고 오류 바는 SD를 나타내고, 분비단백질은 단백질의 mg당 mL당 분비 단백질의 나노그램으로서 24h 배양 배지로부터 정량화되었다, n = 3; ND = 감지되지 않습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2.jpg"> 그림 6: 96 웰 플레이트에서 잘 가변성 평가. (A)HNF4α로 염색된 H9 유래 간 선조의 96웰 플레이트 뷰의 시각화. (b)HNF4α 양성 세포의 정량화. 잘 정량화 당 보기의 여섯 필드에서 행에서 잘 당 셀 수의 평균. 플레이트 전체의 평균 세포 수는 94.81%± 0.22 SEM HNF4α-양수 세포당 양수였다. 우물 사이에통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. (C)HNF4α로 염색된 P106 유래 간 선조의 96웰 플레이트 뷰의 시각화. (D)HNF4α 양성 세포의 정량화. 우물당 평균 셀 수( 잘 및 정량화된 6개의 시야 필드)에서 행의 평균 셀 수입니다. 플레이트 전체의 평균 세포 수는 97.7%± 0.57 SEM HNF4α-양수 세포당 양수였다. 행 간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 웰 H12는 면역글로불린 G(IgG) 염색 제어로 사용되었다. 스케일 바 = 1mm. 투키의 포스트 혹 이후 통계 시험을 통해 일방적인 ANOVA가 채택되었습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>플레이트 형식</td>
			<td>표면적(cm2)</td>
			<td>cm2당 세포</td>
			<td>우물당 총 세포</td>
			<td>디스펜싱 볼륨(mL)</td>
			<td>세포 농도(세포/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24웰 플레이트</td>
			<td>1.9</td>
			<td>210526</td>
			<td>400000</td>
			<td>0.5</td>
			<td>800000</td>
		</tr>
<tr>
<td>96웰 플레이트</td>
			<td>0.32</td>
			<td>187500</td>
			<td>60000</td>
			<td>0.05</td>
			<td>1200000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 프로토콜에 사용되는 hPSC 세포주상이 다른 플레이트 포맷에 대해 권장되는 세포 밀도.

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Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

hepatic-progenitor-specification-from-pluripotent-stem-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

4.6K 조회수.  University of Edinburgh. 이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

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Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

연구

생물학

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...