עבודה זו נתמכה עם פרסים מהפלטפורמה רפואה רגנרטיבית בבריטניה (MRC MR / L022974 / 1 ו MR / K026666 / 1) וכן מלגה סין.

הערה: המידע על הספקים עבור כל חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה כבר מופיע בטבלה 1. כל כלי התקשורת / הצלחות צריכות להיות סטרילי לפחות בטמפרטורת חדר כשתא לבוא במגע ישיר איתם. 1. תאי גזע פלוריפוטנטיים Passaging האדם (hPSCs) על Laminin 521 הערה: ההליך passaging תא כמתואר להלן מבוסס על תאים בודדים והוא אידיאלי עבור הגזירה של אוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי hepatocyte מ hPSCs. ציפוי קולוני הוא גם החלים תואר בעבר 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות מצופה laminin לפי צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המניה 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של laminin רקומביננטי 521 (LN-521) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את LN-521 מופשר ב DPBS 1x קר כקרח (עם Ca 2 + / Mg 2+) לבצע פתרון 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​LN-521 הפתרון מעיל אחד טוב של צלחת 6-היטבורוק להפיץ אותו באופן שווה בתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות באינקובטור תרבות 37 ° C / 5% CO 2 תאים עבור 2 - 4 h לשימוש דחוף או במקרר 4 ° C. לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צלחות מצופה laminin במקרר 4 ° C כנדרש. שמור את הצלחות על משטח שטוח לאטום אותם כדי למנוע אידוי וזיהום. הערה: לעולם אל תניח הבארות המצופות להתייבש; הדף אותם עם תוספת 1x DPBS (עם Ca 2 + / Mg 2+) במידת הצורך. השתמש הצלחות בתוך 2 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר את המספר הדרוש של צלחות מראש מצופה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש או דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס 0.5 - 1 ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את פתרון LN-521 ציפוי מבלי לפגוע המשטח המצופה. הערה: זה קריטי לא לפגוע משטח המצופה לפני זריעת תאים על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום מראש חימם-mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר Rho הקשורים קינאז (ROCK) מעכב Y27632 לאחד גם צלחת 6 היטב. השאר את הצלחת בחממת תרבית תאים לקבל תאים. הערה: לעולם אל תאפשר הבארות מצופות laminin להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום hPSCs מתוחזק היטב ב -75% עד 85% confluency על. שוטפים את התאים מן אחד טוב של צלחת 6-גם פעם אחת עם 1 מ&quot;ל של DPBS 1x-בטמפרטורת החדר (לא Ca 2 + / Mg 2+). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של 1x Accutase אל התאים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 - 8 דקות כדי לנתק את התאים. הערה: כדי לבדוק אם מערכת העיכול הוא מספיק זמן או לא, לטפוח בעדינות את הצלחת לבדוק אם התאים יכולים לנתק בקלות. אם כן, אז זה הזמן לעצור את התגובה האנזימטית; אם לא, להאריך את העיכול עבור 1 נוספת - 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את ניתוק על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של מדיום חדש mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר Y27632 אל התאים. עד פיפטה ומטה בעזרת טיפ P1000 מספר פעמים כדי לעשות השעית תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים קיימא באמצעות hemocytometer.השתמש Trypan כחול כתם או לא לכלול תאים מתים 14 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים. לקבלת passaging hPSC שגרתית, זרע 4 x 10 5 5 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 6-היטב (כלומר, 4.21 x 10 4 כדי 5.26 x 10 4 לס&quot;מ 2). לקבלת passaging hPSCs לבידול hepatocyte, זרע 6.5 x 10 5 כדי 7.5 x 10 5 (כלומר, 6.84 x 10 4 כדי 7.89 x 10 4 לס&quot;מ 2) תאים לכל גם צלחת 6 באר. הערה: צפיפות הזריעה עבור כל קו תא עשויה להזדקק מבוססת אופטימיזציה קטין על הצפיפות האמפירית הניתנת כאן לבידול בכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא הדרוש לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל או 50 מ&quot;ל סטרילי ו צנטריפוגות ב 115 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאט ולאחר מכן resuspend גלולה תא בינוני טרי, חם mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר קינאז Rho-משויך (ROCK) inhibitor Y27632, באמצעות מדיום נאות על מנת להפוך את צפיפות תאים הרצויה. הערה: השימוש מעכב ROCK מומלץ מאוד כדי לשפר מצורף תא שיעור הישרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים על הצלחות המוכנות ולנענע אותם הלוך ושוב לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה. הערה: זה קריטי על מנת להבטיח כי תאים מופצים בצורה אחידה בתוך הבארות אם הצלחת היא לניסויי בידול תרבות או hepatocyte תא שיגרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות בחממה התא לשמור על התאים ב 37 ° C / 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף ולשחזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים למחרת ולסגת מעכב ROCK אם קשר תאי תאים כבר נקבע. לשמור על התאים במדיום mTeSR1 לתרבות שגרתית או לעבור בינוני בידול לפי הצורך. הערה: אם התאים היו זורעים עם צפיפות כאמור, confluency צריך להיות אידיאלי עבור תחזוקה שוטפת או hepatocyte differentiation. </li></ol> 2. ההתמיינות hPSCs לתאים דמויי Hepatocyte על רקומביננטי Laminins <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני בידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון המניות Activin בן אנוש: להמיס האדם Activin אבקת לבצע פתרון המניות 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב אלבומין סטרילי 0.2% שור (BSA) / DPBS. הפוך aliquots קטן ולאחסן אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 1,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון המניות 3a העכבר Wnt: לפזר אבקת 3a העכבר Wnt לעשות פתרון המניה 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA 0.2% סטרילי / DPBS. הפוך aliquots קטן ולאחסן אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך גורם הגדילה hepatocyte האנושי פתרון המניות (HGF): לפזר אבקת HGF האדם לעשות פתרון המניה 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA 0.2% סטרילי / DPBS. הפוך aliquots קטן ולאחסן אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 1,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Oncostatin M (OSM) פתרון המניות: להמיס Oncostatin M (OSM) אבקת לבצע פתרון המניה 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA 0.2% סטרילי / DPBS. הפוך aliquots קטן שלקרע אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 1,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום המניות שאיבה endoderm: 2% תוספת B27 (50x, מינוס ויטמין A) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU / מ&quot;ל ו 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה); הדף עד 500 מ&quot;ל באמצעות רוזוול פארק הזיכרון מכון 1640 (RPMI 1640) בינוני הבסיס. הערה: אחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בינוני Aliquot הממלא ולהוסיף 3a Activin A ו- Wnt טרי (ריכוזים סופיים ב 100 ng / mL ו -50 ng / mL, בהתאמה) בכל שינוי בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום בידול KSR / DMSO: 80% בנוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% נוקאאוט החלפת בסרום (KSR), 0.5% Glutamax, 1% חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA), 0.1 מ&quot;מ בטא mercaptoethanol, 1% DMSO, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU / מ&quot;ל ​​ו 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה). סנן תחת ואקום. חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום התבגרות HepatoZYME: 1% GlutaMAX, 10 הידרוקורטיזון מיקרומטר מלח נתרן 21-hemisuccinate (HCC), ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU / מ&quot;ל ​​ו 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה); דף עד 500 מיליליטר באמצעות מדיום בסיס HepatoZYME. הערה: אחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בינוני Aliquot הממלא ולהוסיף HGF ו OSM הטריים (ריכוזים סופיים ב -10 ננוגרם / מיליליטר ו 20 ng / mL, בהתאמה) עבור כל שינוי בינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hPSCs זרע לבידול hepatocyte על LN-521, כמתואר בסעיף 1. אם LN-521 / LN-111 היא לשמש המצע, מעיל צלחות עם LN-521 לבין LN-111 (1: 3 יחס) ב ריכוז laminin הסופי של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל; טיפול היתר צריך להיות זהה צלחות מצופות LN 521 טהורות. הערה: LN-521 / LN-111 אינו אידיאלי עבור תרבות שגרתית של hPSCs; זה משמש רק לצורך ניסויים בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את התא confluency 24 שעות לאחר זריעה. ליזום התמיינות פעם confluency התא מגיע לכ -40%. Rסר המדיום mTeSR1 בילה ולהוסיף בינוני טרי שאיבה endoderm בתוספת 100 ng / mL Activin A ו- 50 ng / 3a Wnt מ&quot;ל. קוראים הבחנה זו יום 1. הערה: מומלץ מאוד ליזום את הבידול מחרתיים זריעת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום יחול-endoderm כל 24 שעות במשך 3 ימים לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). באשר תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs), להאריך בשלב זה עבור 2 ימים נוספים כדי להתניע את התאים לתאי endoderm דמוי בבירור, אבל להשתמש במדיום שאיבה endoderm שיושלם רק עם 100 ננוגרם / מ&quot;ל Activin A עבור יומיים אלה 12 . הערה: כדי להבטיח מפרט endoderm מוצלח, אפשר לבחון את הביטוי של סמנים endodermal, כגון FOXA2 ו SOX17. לדברי מכתים immunofluorescence, מעל 80% של התאים שמקורם הם חיוביים הם סמנים במעבדה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ל בינוני בידול KSR / DMSO ביום 4 (עבור hESCs) / יום 6 (עבור hiPSCs). שינוי ד הבינוניaily במשך 3 הימים הראשונים ולאחר מכן ביום החמישי של שלב הבחנה זו. הערה: אין האכלה נדרשת ביום הרביעי של שלב הבחנה זו. השתמש KO-DMEM unsupplemented כדי לשטוף את התאים פעם אחת לפני השינוי בינוני אם יש תאים מתים רבים. כדי לבדוק אם הבחנתי בשלב זה הוא מוצלח או לא, אפשר לבדוק את הביטוי של סמני תא אב בכבד, כגון סוכנות ידיעות צרפתית, CK19, ו HNF4A. קרוב ל -90% מכלל התאים יהיו חיוביים עבור סמנים אלה בהתבסס על הניסיון שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים של שלב התמיינות KSR / DMSO, לעבור לשלב הבשל HepatoZYME. שוטף את התאים פעם עם מדיום בסיס רגיל HepatoZYME לאחר הסרת בינוני KSR / DMSO. להוסיף התבגרות HepatoZYME בתוספת בינוני עם 10 ng / mL HGF ו -20 ng / mL OSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את בינונית כל 48 שעות במשך 7 - 10 ימים, בשלב שבו התאים מוכנים לאפיון רגיל או לשימוש נוסף. הערה: בדיקות ביטוי סמן Hepatocyte, מטבוליתבדיקות תפקודיות (כגון פעילות ציטוכרום P450), אוריאת בדיקות הפרשת אלבומין, בדיקות וחוות אחסון גליקוגן, וירוק Indocyanine בדיקות ספיגות (ICG) שיטות אפיון טיפוסיות. הערה: ציר הזמן של פרוטוקול הבידול מוצגת באיור 5. במעבדה שלנו, אנו שגרתי לבדוק את רמות ביטוי סמן &#39;hepatocyte ספציפי HLCs נגזר, הפרשת אלבומין, ו ציטוכרום P450 (CYP) 3A ופעילות 1A2. </li></ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells.">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+innate+immunity+improves+hepatitis+C+virus+infection+and+replication+in+stem+cell-derived+hepatocytes.">Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).</li><li>Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+modulation+of+hepatocyte-like+cell+function.">Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function.</a> Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+stem+cell+derived+human+hepatocytes+for+experimental+medicine.">Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li><li>Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+functional+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+under+chemically+defined+conditions+that+recapitulate+liver+development.">Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development.</a> Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).</li><li>Touboul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+regulation+of+the+WNT/beta-catenin+pathway+enhances+differentiation+of+hESCs+into+hepatocytes.">Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes.</a> J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+by+HNF4alpha+transduction.">Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction.</a> Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+ES/iPS-derived+hepatoblast-like+cells+on+human+laminin+111-coated+dishes.">Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cell+populations.">Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations.</a> J Vis Exp. (56), e2969 (2011).</li><li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta1+modulates+extracellular+matrix+production,+proliferation,+and+apoptosis+of+endothelial+progenitor+cells+in+tissue-engineering+scaffolds.">Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds.</a> Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).</li><li>Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+extracellular+matrix+components+are+necessary+for+definitive+endoderm+induction.">Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction.</a> Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+hepatic+regeneration.+Localization+of+collagen+types+I,+III,+IV,+laminin,+and+fibronectin.">The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin.</a> Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).</li><li>Lorenzini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+stereotypical+cellular+and+extracellular+adult+liver+progenitor+cell+niche+in+rodents+and+diseased+human+liver.">Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.</a> Gut. 59 (5), 645-654 (2010).</li></ol>

ד&quot;ר David C. Hay הוא מייסד שותף ומנהל Stemnovate מוגבל.

כדי לקדם את המחקר בתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם ורפואת translational, מערכות ללא קסנו אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות ייצור נאותות נוכחיות נדרשות. המפתח לכל תהליך הבידול הוא תאי מטריקס (ECM). ה ECM לא רק תומך מצורף תא, אלא גם מספק גישה לגורמי איתות מפתח, המשפיע תא נחישות פנוטיפ 25, 26. Laminins הם חלבוני מטריצה רבים תכליתיים תאיים in vivo. בכבד, הפרשת laminin היא קריטית עבור התחדשות כבדה לאחר כריתה חלקית 27 והוא נחוץ לצורך תחזוקת תאים ובתאים בכבדים 28. חשיבותה של laminins בתחזוקה כבדה והתחדשות הייתה הבסיס לבדיקה זמין מסחרי laminins האנושי רקומביננטי במערכת בידול hepatocyte שלנו. Superior הואבידול patocyte הושג על LN-521 לבין LN-521 / LN-111 מצעים בהשוואת Matrigel. HLCs נגזר היו מקוטב ברורים ומאורגן בצלחת, ותפקוד הסלולר שלהם השתפר באופן משמעותי בהשוואה לעמיתיהם תערובת חלבונים הדביקים שלהם. ביסוד שיפורים אלו היה downregulation של זיהום colon-, fibroblast- גזע גנים הקשורים התא על laminins, כמו גם ירידה התפשטות תאים ו -10 ביטוי גנים הקשורים הגירה. לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מייצר תאים דמויי hepatocyte שקרובות יותר באופיים hepatocytes אדם בוגרים. התהליך ניתן לשחזור, מקובל האוטומציה, והוא יכול להיות חסכוני מדורג עבור יישום. חשוב לציין, יצווה אל תצווה וריאציה כבר ירדה באופן משמעותי בהשוואה לטכניקות משתמשות Matrigel, וכתוצאה מכך מערכת בידול משופרת עבור חוקרים בתחום זה. </p&gt;

רקמה אנושית ראשונית ואת סוגי תאי נגזרים משמשים באופן קבוע, הוא להקרנה מבוססת תאים ו במרפאת. עם זאת, גישת התאים אלה מוגבלים קשה בשל תרומת איברים מספיק ואובדן פנוטיפים תא פוסט-בידוד 1. hPSCs מייצג אלטרנטיבה מבטיחה לרקמות ראשוניות להקל על הדור של תאי סומטיים אדם גנטי מוגדרים ומתחדשים. תאי Hepatocyte דמוי (HLCs) נגזרים hPSCs כבר הראו הבטחה בתחום זה. HLCs להידמות hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה בהיבטים שונים, כולל מורפולוגיה התא, ביטוי גנים hepatocyte, התפקוד המטבולי, ורגישות לתרופות ווירוסים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. בנוסף, ריבוי ללא הגבלהקיבולת התחדשות עצמית של שני hPSCs שחוקר ו- GMP הכיתה הופכת לפשוט בקש 9, 10. יותר מעשור של מחקר פיק מספר נהלי בידול hepatocyte היעיל 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. עם זאת, רוב המערכות הללו להשתמש ברכיבים מוגדרים ו / או תמרה ויראלית לנהוג מפרט hepatocellular. כדי לשפר את האמינות של הטכנולוגיה בקנה המידה, חשוב לפתח בידול hepatocyte חזקמערכת מוגדרת באמת ונטול קסנו, ו- GMP תואם. Laminins (LNs) הם חלבוני מטריצה ​​חשובים תאיים שיכול להשפיע הידבקות תא, התפשטות, הגירה, והבחנה. Laminins הם גליקופרוטאינים heterotrimeric מורכב α אחד, β אחד, ושרשרת γ אחד. לאחרונה, laminins אנושי רקומביננטי הופקו ומשמש בביולוגיה של התא. LN-511 הוכחו לתמוך התחזוקה של hPSCs 21, תוך תערובת של LN-521 ו- E-cadherin מאפשרת גזירה משובטת והרחבה בתאי גזע עובריים אנושיים 22. LN-111, מצד שני, תומך בשמירה על תאי hepatoblast דמוי נגזר hPSCs 23. עם זאת, לפני הדו&quot;ח שלנו, laminins 521 ו -111 לא נוצלו כדי ליצור HLCs עם מאפיינים בוגרים מ hPSCs 10. כאן, אנו הליכים פרט עבור culturing hPSCs על LN-521ומבדל אותם משני LN-521 או תערובת של LN-521 לבין LN-111 (LN-521 / LN-111). אנחנו מותאמים פרוטוקול הבידול באמצעות זריעה מתחיל מתא בודד ליצור בשכבה לשחזור הומוגנית מאוד של HLCs בפורמטים רבים 14. אנו מאמינים כי מערכת הבידול המוגדרת שלנו מייצגת שיטה פשוטה וחסכונית לייצר HLCs הפעיל עבור יישום, מייצג צעד משמעותי קדימה בתחום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 111</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN111-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells

תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) להחזיק ערך רב למחקר ביו. hPSCs וניתן לשנותם בדיל לכל סוגי התאים נמצאים בגוף האדם. הבידול של hPSCs לתאי hepatocyte דמוי אדם (HLCs) נחקר בהרחבה, ופרוטוקולי בידול יעילים הוקמו. השילוב של תאי מטריקס וגירויים ביולוגיים, כוללים גורמי גדילה, ציטוקינים, ומולקולות קטנות, הפך אותו ניתן להפיק HLCs דומה hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה. עם זאת, הרוב המכריע של הליכים עדיין להעסיק רכיבים בלתי מוגדרים, והוליד יצווה אל תצווה וריאציה. זה משמש כמחסום משמעותי ליישום של הטכנולוגיה. כדי להתמודד עם בעיה זו, פיתחנו מערכת מוגדרת לבידול hepatocyte באמצעות laminins רקומביננטי אנושי כמו מטריצות תאיים בשילוב עם תהליך התמיינות סרום ללא. מאוד מפרט hepatocyte ביותר הושג, עם דהmonstrated שיפור בתפקודי לבין פנוטיפ היא HLC. חשוב לציין, מערכת זו היא קלה בהיקף של עד באמצעות קווי hPSC מחקר GMP כיתה מקדמות מבטיח בדוגמנות מבוססת תאים וטיפולים.

בידול hepatocellular מ hPSCs שורת תאים עובריים אנושיים גזע אחת, H9, וקו תא גזע מושרים אדם אחד, 33D6, שימשו בידול hepatocyte. התוצאות במספרים 1-3 הם מתאי H9, בעוד אלה באיור 4 הם מתאי 33D6. תאים בודדים זורעים על laminins יצרו קשר תאי תאים לאחר 24 שעות. אחרי התאים הגיעו כ -40% confluency, את תהליך הבידול יזמה (איור 1A ו איור 4 א). ביום laminins (הן LN-521 לבין LN-521 / LN-111), תאים אלה עברו שינויים מורפולוגיים רציפים הולידו HLCs המקוטב (איור 1 והאיור 4A). Hepatocyte דמוי אפיון נייד Day 18 HLCs נאספו שלהם ונבחנת לגביהם ביטוי של סמנים hepatocyte נציג, HNF4A ו ALB (איור 2 א). Immunostaining של יום 18 HLCs הראה כי קרוב ל -90% מכלל התאים הביע HNF4α (איור 2 ב). תאים אלה מקוטבים על laminins והציגו מראה מצולעים, כמסומן על ידי E-cadherin וביטוי F- יקטין (איור 2 ב). ציטוכרום P450 (CYP) פעילות הוערכה גם. CYP450s לערוך התפקוד המטבולי החשוב של hepatocytes. יום 18 HLCs נגזר על תערובת חלבון דביקה, כגון Matrigel, LN-521, או LN-521 / LN-111, נבדק לפעילות CYP3A. HLCs הפגין באופן משמעותי פעילות CYP3A גבוהה על מצעי laminin מאשר על matrigel (איור 3). חשוב לציין, בהשוואה hepatocytes העיקרי האדם מסחרי (HU1339) מחדש מצופה על מצעים אלה, יש HLCs כמעט 10 גבוה פי רמותשל CYP3A פעילות 10. ההבחנה בין hiPSCs היה דומה לזה של hESCs. התאים מתגלים שינויים רציפים במראה (איור 4 א). HLCs נגזר הביעו גורם שעתוק hepatocyte מפתח, HNF4α (איור 4B), ובעל פעילות CYP3A ואלבומין מופרשים (איור 4C ו- D). יש לציין, HLCs נגזר 33D6 מוצג מופחת CYP3A בהשוואה לתאים H9 נגזר HLCs (איור 3), אבל זה עדיין היה דומה hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה 10. עם זאת, הפרשת אלבומין של HLCs אלה היה נמוך בהרבה מאשר hepatocytes העיקרי 10. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> איור 1: שינויי מורפולוגיים סדרתית במהלך ההתמיינות כבדיה. &lt;/ strong&gt; (א) hESCs המובחן זורע כמו תאים בודדים הגיעו כ -40% confluency 24 שעות לאחר זריעה. (ב) לאחר תחול, תאים הציגו את מורפולוגיה endodermal הטיפוסית ביום 4. (ג) כשמגיעים לשלב כמו-hepatoblast, הם הראו צורה מצולעים ברורה ביום 9. (ד) לאחר שלב ההתבגרות, HLCs המקוטב היו מוכן אפיון נוסף שמוצג כאן ביום 18. בר סולם = 200 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> איור 2: אפיון של HLCs. (א) התבטאות גנים של סמנים ספציפיים hepatocyte, HNF4A (משמאל) ALB (מימין). רמת הביטוי נותחה באמצעות יום 18 HLCs נגזר<html> מ hESCs משני LN-521 לבין LN-521 / LN-111, וזה היה מנורמל GAPDH גן משק והביע ביחס hESCs. התוצאות ייצג שלושה משכפל ביולוגי, ואת ברי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01; מבחן t מזווג. (ב) ביטוי חלבון של סמן כבד מפתח, HNF4α, וסמני קיטוב, E-cadherin ו- F יקטין. HLCs יום 18 על LN-521 לבין LN-521 / LN-111 היו מוכתמים עבור הסמנים לעיל counterstained עם Hoechst 33342. כביקורת שלילית בוצע עם אימונוגלובולינים המקבילים G (IgG). אחוז התאים HNF4α החיוביים ואת SD מוצג. זה חושב מתוך ארבעה שדות אקראיים. תמונות צולמו בהגדלה 20X. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> .within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig3.jpg" /> איור 3: אפיון התפקוד המטבולי של HLCs. פעילות ציטוכרום P450 של CYP3A של תאים בתרבית על Matrigel (MG), LN-521, או LN-521 / LN-111 נבדק. הנתונים מייצגים שלושה משכפל ביולוגי, ואת ברי השגיאה מייצגים SD. ** P &lt;0.01; חד סטרי ANOVA עם מבחן פוסט הוק של Tukey. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> איור 4: אפיון תקן של HLCs. hiPSCs בתרבית על LN-521 הובדלו לתוך HLCs. בדיקות אפיון תקן בוצעו ביום 17 HLCs. (א) המורפולוגיה הרציפה של התאים במהלך בידול כבד; נקודות הזמן שמוצג r<html> תאי epresent בימים 1, 4, 9, ו -17 (ב) Immunostaining ביטוי HNF4α. אחוז התאים החיוביים ואת SD מוצג מבוססים על ארבעה שדות אקראיים. תמונות צולמו בהגדלה 20X. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) פעילות CYP3A ביום 17 HLCs. הנתונים מייצגים שש ביולוגי משכפלים, ובר השגיאה מייצג את SD. (ד) הפרשת אלבומין של HLCs נגזר על 24 שעות בתרבות. הנתונים מייצגים ארבעה ביולוגי משכפלים, ובר השגיאה מייצג SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> איור 5: ציר זמן סכמטי של פרוטוקול הבידול.t = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

השיטה המוצגת כאן מתארת ​​בפועל ייצור מדרגים טובים (GMP) מערכת בידול -ready לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם מתאי גזע פלוריפוטנטיים. היא משמשת חסכונית מערכת הסטנדרטית כדי לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם למחקר כבד בסיסי ויישומי אדם.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

defined-scalable-generation-hepatocyte-like-cells-from-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K Views.  University of Edinburgh.  השיטה המוצגת כאן מתארת ​​בפועל ייצור מדרגים טובים (GMP) מערכת בידול -ready לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם מתאי גזע פלוריפוטנטיים. היא משמשת חסכונית מערכת הסטנדרטית כדי לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם למחקר כבד בסיסי ויישומי אדם. 

Video: Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...