פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר לנו ללמוד את הפונקציה של חלבונים, כגון חלבוני מטריצה חוץ תאית, כי הם up-regulated בשלבים מאוחרים יותר של היווצרות myotube או התבגרות. שיטה זו יכולה לשמש כדי להפיל כל גן של עניין בתאי C2C12 באמצעות shRNAs ספציפיים ואת הכלים האנליטיים המתאימים עבור פנוטיפים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שיצרנו תאי C2C12 שיכולים לדכא ללא הרף את הגנים המעניינים שלנו, אפילו במיאוטובים בוגרים.
ההיבט החשוב ביותר של הליך זה הוא לשמור על תאי C2C12 במצב מויש, כלומר בצפיפות תאים נמוכה במהלך תרבות תאים שגרתית. יום לפני ההמרה, זרעים חמש פעמים 10 לתאי C2C12 הרביעי למיליליטר בשני מיליליטר של DMEM שלם לגם בצלחת שש באר כדי להשיג 40 עד 50% confluence לאחר הדגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2. למחרת בבוקר, לשלב 100 microliters של 25 מילימולר נתרן כלורי אחד 1.5 מיליליטר תגובה צינור לכל תרבות גם עם 25.5 microliters PEI פתרון מלאי של תרבות תאים C2C12 מוצהר עבור דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לשלב שלושה מיקרוגרם של DNA פלסמיד עם 100 microliters של 25 מילימולר נתרן כלורי לכל תרבות גם עבור דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשלב את כל הנפח של כל ריאגנט PEI מדולל עם כל פתרון פלסמיד מדולל עם צינור עדין עבור דגירה של 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה, החלף את העל-טבעיים של תרבות התאים C2C12 ב- DMEM ללא אנטיביוטיקה או סרום.
בסוף הדגירה, מוסיפים את כל הנפח של כל תערובת transfection לכל באר טיפות, תוך הזזה מתמדת של צלחת תרבות התא. לאחר שש שעות באינקובטור תרבות התא, החלף את המדיום בכל באר עם DMEM מלא. 24 שעות לאחר ההחלפה, להחליף את DMEM מלא בכל באר עם מדיום הבחירה בתוספת חמישה מיקרוגרם למיליליטר של puromycin, ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 10 עד 14 ימים או עד תאי C2C12 יציבים נצפו.
לאחר מכן להרחיב את תאי C2C12 עמיד puromycin בתרבות צפיפות תאים נמוכה בנוכחות חמישה מיקרוגרם למיליליטר של puromycin, ו cryopreserve שישה עד 10 בקבוקונים של תאים לשימוש עתידי. כדי להכין את התאים C2C12 להתמדה, זרע 1.5 פעמים 10 לתאי C2C12 עמידים puromycin יציב החמישי במיליליטר אחד של מדיום הבחירה לגם בצלחת 12 באר, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד התרבויות הם 95% נוחים. כדי לגרום להתבירות, החלף את המדיום בכל באר ב- DMEM ללא סרום כל יומיים לאחר היווצרות המיוטובה במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך המצויד במצלמה.
עבור immunostaining שרשרת כבדה myosin של התאים המובחנים, זרע חמש פעמים 10 לתאי C2C12 עמידים puromycin הרביעי ב 500 microliters של DMEM מלא לכל תא על שקופית תא שמונה בארות, ולהחזיר את התאים לאינקובטור תרבות התא. כאשר התאים מגיעים ל- 95%confluency, החלף את אמצעי הבחירה בכל באר ב- 500 מיקרוליטרים של DMEM ללא סרום. בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות, שטפו את התאים המביאים בכל באר שלוש פעמים עם 5 מיליליטר של PBS לכביסה לפני תיקון התאים עם 200 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde ב- PBS לגם.
לאחר 15 דקות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS טרי לכל לשטוף כפי שהודגם רק ואחריו דגירה עם 200 microliters של 5-טוחן גליצין ב PBS לכל באר במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים לפני permeabilizing התאים עם 200 microliters של 1% לא יוני פעילי שטח PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן, חסום את אתרי איגוד הנוגדנים הלא ספציפיים עם 200 מיקרוליטרים של אלבומין סרום 5%bovine ב- PBS למשך שעה אחת ואחריו שלוש שטיפות ב- PBS.
לאחר הכביסה האחרונה, סמן את התאים עם 200 microliters של נוגדן שרשרת כבדה myosin במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות PBS, הדגירה את התאים עם הנוגדן המשני המתאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאחר שלוש שטיפות סופיות, שאפו את ה-PBS והרו את התאים עם טיפה אחת של מדיום הרכבה בתוספת DAPI וכיסוי.
לאחר מכן התבונן בכל תא במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ערכת המסננים המתאימה. כדי להעריך את יעילות ההפלה בתרביות התא על ידי כתמים מערביים, הזרע הראשון שלוש פעמים 10 לתאי C2C12 עמידים puromycin החמישי בשני מיליליטר של DMEM שלם ל הבאר בצלחת שש באר. לאחר 24 שעות, לשטוף את התרבויות עם PBS, וליזום בידול של התאים עם שני מיליליטר של DMEM ללא סרום כפי שהוכח.
לניתוח החלבונים המופרשים בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות, אספו מיליליטר אחד של מדיום מותנה ללא סרום מכל באר לצינורות תגובה בודדים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, להעביר מיליליטר אחד של supernatants בינוני מותנה לתוך צינורות תגובה חדשים 1.5 מיליליטר, ולזרז את החלבונים עם 391 microliters של חומצה טריכלורואצטית ב חומר שטח לא יוני לכל צינור. לאחר 30 שניות של מערבולת, הדגירה את תערובות על הקרח במשך 10 דקות.
בסוף הדגירה, גלולה חלבונים זירז על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את כדורי החלבון שלוש פעמים עם אצטון קר כקרח טרי צנטריפוגה אחת לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את הכדורים במשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר לפני ההתמזגות ב 50 microliters של חיץ מדגם SDS-PAGE לכל צינור. ואז להרתיח את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס לפני ניתוח כתם מערבי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לניתוח חלבונים תאיים וממברנה, שטפו את שכבת התא בכל באר עם שני מיליליטר של PBS ל הבאר, ולהשתמש במגרד תאים כדי לנתק בזהירות את התאים בנפחים של מיליליטר של PBS. העבר את התאים לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה ואחריו שלוש שטיפות במיליליטר אחד של PBS לצינור לכל לשטוף באמצעות צנטריפוגה. לאחר הכביסה האחרונה, יש לחדש את כדורי התא ב-200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה בתוספת ריג'נט קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא EDTA עבור דגירה של 30 דקות על קרח.
בסוף הדגירה, אולטרסאונד את הדגימות במשך 15 שניות על קרח עם הגדרת תפוקת חשמל של 10 בתדר פעולה של 23 קילוהרץ, ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה. מעבירים את העל-טבעיים לצינורות תגובה חדשים של 1.5 מיליליטר, וקובעים את ריכוזי החלבון בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים. שלבו 100 מיקרוגרם חלבון עם מאגר דגימה של 5X SDS-PAGE בנפח כולל של 60 מיקרוליטרים לדגימה, והרתיחו את הדגימות במשך חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לנתח את הדגימות על ידי כתמים מערביים לנוכחות של חלבון היעד הרצוי. הבחירה של תאי C2C12 עמידים puromycin ניתן להשיג בתוך 10 עד 14 ימים של transfection עקב חיסול יעיל של תאים שאינם עמידים. בדרך כלל, יותר מ-80% מתאי C2C12 מתנתקים ממכל תרבות התאים במהלך פרק זמן זה ומוסרים במהלך תחזוקת תאים שגרתית.
תאי C2C12 עמידים בפני פורומיצין המבטאים את הבקרה או את ה-ADAMTSL2 shRNA שומרים על מורפולוגיה תאית מוארכת בצורת ציר בצפיפות תאים נמוכה, כמו גם את יכולתם להתבדל למיאוטובים. C2C12 בידול על נסיגת סרום ניתן לפקח על ידי מיקרוסקופיה שדה בהיר immunostaining עבור סמן myotube מיוסין שרשרת כבדה. Myosin מיוטובים שרשרת חיובית כבדה נצפו בין שלושה לחמישה ימים לאחר התחלת הבידול והם multinucleated, כפי שנצפה על ידי נוכחות של יותר מגרעין אחד DAPI חיובי בתוך גבולות התא.
כפי שניתן לבצע את נתוני ביטוי הגנים בתנאי התפשטות, יעילות ההפלה של ההשתנות היא 40 עד 60% ניתוח כתמים מערביים ניתן לבצע כדי לאשר את ההצלחה של ההפלה בליסטים התא המתקבלים, למשל, מתאי C2C12 המבטאים באופן הדוק shRNA כי מטרות ADAMTSL2 לעומת בקרת shRNA הבעת תאים. הקפד לשמור על ריכוז puromycin במהלך תהליך הבחירה גבוה מספיק כדי לחסל את כל התאים C2C12 שאינם מנוקטים, או התאים שאינם מנוקטים עשויים להפוך את התאים מנוקטים. תצהיר זה מאפשר לנו לקבוע את הפונקציה של חלבוני מטריצה חוץ תאית שבאים לידי ביטוי מאוחר יותר בהתפתחות השרירים, גם אם הם המושרים חמישה או 10 ימים לאחר ההידול C2C12.
זכור כי ריאגנט מיצוי RNA ובטא-mercaptoethanol צריך להיות מטופלים ברדס אדים כדי להתמודד עם חומצה trichloroacetic על פי פרוטוקולי הבטיחות המתאימים. תודה על הצפייה, ובהצלחה עם הניסוי שלך.
