פרוטוקול זה מאפשר התפתחות של נוק-אאוט של תאי שריר בכל גן, על מנת לחקור עוד יותר את תפקודו של גן זה בשריר. היתרון הוא שזה זול ומהיר יותר מהתפתחות של חיות נוק-אאוט לחקור כל גן. טכניקה זו יכולה לשמש, למשל, כדי לחקור את המעורבות של גן שזוהה לאחרונה במיופתיה.
אם הטכניקה המתוארת כאן מיושמת על תאי iPS היא יכולה להוביל להתפתחות של תאי נוק-אאוט עבור כל גן בכל סוג של תאים. כדי להתחיל באשכולות של חזרות פלינדרומיות קצרות באופן קבוע או מחיקת גנים בתיווך CRISPR, השתמש תחילה בכלי דפדפן גנומיים כמו ensembl. כדי לזהות את גן המטרה יחד עם רצפי הדנ"א משני צידי גופו.
כדי לקבל את רשימת האקסונים של הגנים, תחילה לחץ על התעתיק של רצף קידוד החלבונים ולאחר מכן על אקסונים. לאחר מכן, לחץ על הורד רצף ובחר רק רצף גנומי כדי להוריד את רצף הקונצנזוס המלא של הגן כולו. גלול את רשימת האקסונים והאינטונים של הגן כדי לבחור את הממוקדים.
לתכנון רנ"א מנחה, בחרו תחילה רצפי נוקלאוטידים של האינטרונים במעלה הזרם ובמורד הזרם של רצף המטרה. לאחר מכן עבור אל אתר כגון crispr.tefor. נטו ולהשתמש ברצפים שנבחרו כדי לתכנן שני רנ"א מנחים, כל אחד באורך 20 נוקלאוטידים ללא המוטיב הסמוך Protospacer המופרד על ידי כמה מאות זוגות בסיסים.
לאחר מכן קבעו את רצף המשלים ההפוך עבור כל רנ"א מנחה והזמינו את הפריימרים. כדי לבנות קלטות RNA מנחות לשיבוט פלסמיד, תחילה הפעל PCR עם קבוצה אחת של פריימרים באמצעות המתכון והתוכנית המתוארים בטקסט, ולאחר מכן הפרד את מוצרי ה- PCR בג'ל 1% אגרוז באמצעות מאגר Tris-borate-EDTA. לאחר מכן לבלות את השבר הזוגי בן 300 הבסיסים ולטהר באמצעות ערכה.
באופן דומה, לאחר הרצת PCR נוסף עם ערכת הפריימרים האחרת, מטהרים מקטע דנ"א ארוך של זוג 400 בסיסים ל-20 מיקרוליטרים של מאגר אלוטציה. כדי להחדיר את קלטות ה-RNA המנחות לתוך עמוד שדרה של פלסמיד לנטי-ויראלי, הגדר תחילה תגובת עיכול כפולה של הפלסמיד עם אנזימי ההגבלה חג המולד 1 ו-Blp 1 כמתואר בטקסט. לאחר הדגירה של צינור התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, דוגרים אותה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז מפעילים את תוצר העיכול בג'ל אגרוז של 1% ומטהרים את הפלסמיד של זוגות של כ-10 קילו-בייס באמצעות ערכה מתאימה.
כמו כן לכמת את המוצר המטוהר על ידי מדידת הצפיפות האופטית. כדי ללטף את קלטת הרנ"א המנחה עם הפלסמיד, הכינו תערובת תגובה עם הרנ"א המנחה המטוהר, הדנ"א, האנזים והמים של הפלסמיד הליניארי לנפח סופי של 10 מיקרוליטרים, ואז דגגרו את צינור התגובה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי ליצור את הפלסמיד הסופי, הנקרא pGuide. לייצור נגיף הלנטי, זרעו תחילה צלחת באורך 145 ס"מ עם מיליון תאי HEK 293 ב-DMEM עם גלוקוז גבוה ופירובט בתוספת 10% FBS ו-1%פניצילין או סטרפטומיצין.
לאחר מכן מגדלים את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים בחממת פחמן דו-חמצני של 5%. ביום הרביעי לבדוק את התאים כדי להבטיח 60 עד 65% מפגש. לאחר מכן להכין את תמיסת הטרנספקציה המורכבת מפלסמיד העניין, הפלסמיד המקודד את מעטפת הנגיף, פלסמיד האריזה הלנטי-ויראלית פלסמיד psPAX2, וסידן פוספט.
התאם את הנפח הסופי ל- 1000 מיקרוליטרים באמצעות מים. לאחר מכן הוסיפו את תמיסת הטרנספקציה באופן טיפתי למיליליטר אחד של 2X HBS תחת תסיסה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוסף את הפתרון באופן טיפתי לתאים.
עבור התפלגות הומוגנית של תמיסת הטרנספקציה, הטה בעדינות את הצלחת לכל הכיוונים, ואז הדגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני של 5% למשך חמש שעות לפחות. לאחר מכן, להסיר את המדיה מן הצלחות ולשטוף את התאים עם PBS כדי להיפטר מגיבים transfection, ולאחר מכן להוסיף 12 מיליליטרים של מדיום טרי. לאחר 48 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, רכזו את המדיה מכל הצלחות לצינור.
שים את הצינור בדלי אטום וצנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז סנן את הסופרנאטנט באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר וצנטריפוגה את התסיס ב 68, 300 פעמים G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות רוטור דלי מתנדנד. לאחר הסרת ה-supernatant, שמרו את הצינורות הפוכים על מגבת נייר בארון בטיחות למשך חמש עד 10 דקות להסרה מקסימלית של נוזלים מהכדורים. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות HEC ושמרו על הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
לאחר מכן החיזרו את הכדור על ידי צנרת. לאחר איסוף כל הכדורים המחודשים, הכינו אליקוטים של 10 או 25 מיקרוליטרים, ואז אחסנו את האליקוטים במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת הצמדה במימן נוזלי. עבור התמרת מיובלסט, זרע ראשון כל באר של צלחת של 96 בארות עם 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות המכיל 10, 000 תאי מיובלסט.
למחרת, הוסף נפחים מחושבים מראש של מדריכי LV ו- LV Cas9 לתאים בארון בטיחות. לאחר חמישה ימים של דגירה, שחררו את התאים מהבאר על ידי הוספת טריפסין. לאחר ספירת מספרי התאים, העבירו את התאים מבארות עם 40% עד 50% מפגש לצלחת חדשה.
לאחר חמש שעות של דגירה, הוסיפו נפחים מחושבים של רוצח LV בריבוי של זיהום של 20 ודגירה במשך חמישה עד עשרה ימים או לפחות שני מעברים בין לבין. לאפיון פונקציונלי של שיבוטים ערוכים גנטית על ידי הדמיית סידן, צלחת 50, 000 תאים במרכז צלחת 35 מילימטרים מצופה למינין. כדי לגרום להבחנה, הוסף את מדיום ההבחנה כמתואר בטקסט.
לאחר שישה ימים של דגירה, הורידו את מדיום התרבית ותחמו את התאים בעט הידרופובי. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של Fluo-4 Direct, מדולל אחד לאחד במדיום ההבחנה, למיו-טיובים המובחנים. לאחר דגירה של הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם כרית קרבס בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר גלוקוז.
לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של פי 10 למדוד את הווריאציות הפלואורסצנטיות בקצב של פריים אחד לשנייה למשך 90 שניות ולבחור שדה עם לפחות 10 מיו-טיובים. לאחר הסרת חיץ Krebs נוסף, לעורר את התאים עם שני מיליליטרים של אשלגן כלורי עבור דה פולריזציה של ממברנה או שני מיליליטרים של metacresol florochloral או 4CmC או RyR1 גירוי ישיר. דמיינו את הווריאציה הפלואורסצנטית לאחר הגירוי, ואז כימתו את השונות הפלואורסצנטית בכל מיויוטיוב.
פרוטוקול זה יכול לשמש בהצלחה כדי להפיל את הגן RyR1 ממיובלסטים אנושיים, מה שהביא לדנ"א גנומי קצר יותר בתאים. נוק-אאוט RyR1 אושר גם ברמת החלבון מכיוון שלא ניתן היה לזהות את החלבון RyR1 בתאים הממוקדים על ידי כתם מערבי. היעדר פעילות RyR1 במיוטובים המובחנים מתאי הנוק-אאוט של RyR1 אומת עוד יותר על ידי הדמיית סידן Fluo-4 לאחר גירוי RyR1 ישיר על ידי 4CmC או גירוי עקיף על ידי דפולריזציה של ממברנה הנגרמת על ידי אשלגן כלוריד.
הרצף שיימחק צריך להידרש לחיזוי של חלבון פונקציונלי. טכניקה זו אידיאלית לפיתוח כלים פוסט-גנומיים לחקר המעורבות של גנים חדשים במחלות שרירים.
