דושן הוא ניוון שרירים הגורם מתיש מוקדם מדי של תאים הצאצאים שריר. זהו אחד הדיסטרופיות השריריות החמורות ביותר. כדי לקדם התחדשות שרירים תפקודית, אנו משתמשים בעריכת גנים בתווך CRISPR/Cas9 כדי לשחזר ביטוי דיסטרופין בתאי האב של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים.
לעריכת הגנים CRISPR-Cas9 יש פוטנציאל לשחזר ביטוי גנים של דיסטרופין. תאי שריר אוטולוגיים שמקורם ב- iPSC יכולים לחדש את נקבובית תאי הגזע, לתקן נזק ולמנוע סיבוכים נוספים ב- DMD מבלי לגרום לתגובה חיסונית. סוכנים שונים של תאי iPS לתוך תאי אבי העורף Myogenic הפחיתו את הסיכון של גידול מחדש בראשית בתאי iPS.
מספר טיפולים המשלבים תאים מונעים אוטומטית תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי שרירים עם תיקון גנטי בתיווך CRISPR-Cas9 מבטיחים אסטרטגיות מבטיחות לטיפול בניוון שרירים של דושן. טכנולוגיה זו יכולה לשמש לטיפול במחלות מולדות רבות על ידי עריכה גנטית של תאי גזע אוטולוגיים, כולל מחלות לב, מוח ודם. הראינו שהדגמה של גישה זו יכולה לספק לקוראים ניסיון בטיפול בתכנות מחדש של תאים ועריכת גנים, מה שנותר אתגר.
תחת מיקרוסקופ הפוך, לבחון את המושבות של תאי גזע עובריים עכבר נגוע. סמן את המושבות בתחתית המנה באמצעות סמן האובייקט בדיו עצמית. החל טבעות שיבוט משומנים כדי לכסות את מושבות התא המסומנות.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA לכל טבעת שיבוט והצבו את הצלחת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, להעביר את התאים מתעכלים עם 100 מיקרוליטר פיפטה טיפים 48-well צלחות תרבות המכיל 250 מיליליטר של MES צמיחה בינונית. אין לארוב את התאים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו 85% לחות.
כאשר הם קוראים 70%confluence, לבחור את בארות עם תאים בוגרים היטב ולהוסיף 250 מיליליטר של פתרון TVP לעיכול במשך 30 דקות. לאחר מכן, להעביר את תרבות התא מכל באר לצלחת שישה סנטימטרים. חזור על החלת טבעות שיבוט ודגירה במשך מספר פעמים עד שיבוטים אחידים, בצורת מעונות מתקבלים.
עכשיו, לעכל את iPSCs העכבר מוכן על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון TVP. מעבירים את תרבות התאים לצלחת 24 באר מצופה פיברונקטין וג'לטין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שהתאים מגיעים ל-50%, עברו ל-500 מיקרוליטרים של מדיום תרבות טרי המכיל שמונה מיקרוגרם למיליליטר פוליברין.
לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון החלקיק lentiviral iPSCs העכבר. דגירה התאים במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לקבוע את הריכוז המינימלי של Blasticidin ו Hygromycin B אשר בחצי שיעור להרוג בתוך 24 שעות.
הוסף את המדיה של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר Blasticidin ו 100 מיקרוגרם למיליליטר Hygromycin B לתאים, לחכות שלושה ימים, ולבחור את התאים שנותרו חסידים כמו תאים נגועים מייצבים. לעכל את iPSCs העכבר שנבחר עם 0.5 מיליליטר של פתרון TVP, כל באר בצלחת חדשה 24 באר, ותאי דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, פיפטה iPSCs לתוך תאים בודדים לספור את התאים עם תא ספירת תאים.
בחר כ -150 תאים בודדים מתעכלים ולדלל עם MES בינוני לתוך צלחת 10 ס"מ, תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר כ-10 ימים, תחת מיקרוסקופ הפוך, השתמשו ב-10 טיפים סטריליים זעירים כדי לבחור מושבות בודדות ולהעביר כל מושבה ל-50 מיקרוליטרים של פתרון TVP בצלחת של 96 בארות. לעכל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
קטיף שיבוט ידני אמין הוא קריטי להצלחה של קצירת CRISPR / Cas9 בעריכת תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה. לאחר מכן, להעביר ולחלק את התאים מתעכלים מכל באר לעוד שתי צלחות תרבות 96-well. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד 70% confluent.
עם מושבות התא ב 70%confluence, להסיר את המדיום בצלחת 96 באר. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של ריאגנט Lysis המכיל 1%Proteinase K פתרון לכל באר והעבר את ה-lysate לצלחת PCR נוספת של 96 באר. לאטום את צלחת PCR עם אטמים דבק להידגר את הצלחת במחזור תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות כדי ללטף את התאים ולנפח את Proteinase K.Then, בצינור PCR, להוסיף שני microliters של lysate, 10 microliters של 2x DNA פולימראז Premix, 7 microliters של מים ללא DNase ומיקרוליטר אחד של פריימרים DMD Exon23.
התחל את תגובת PCR על פי כתב היד. לאחר מכן, לטעון את תגובת PCR מסופק עם 2.2 microliters של מאגר טעינה על 2%agarose ג'ל. הפעל את הג'ל ב 100 עד 150 וולט במשך 30 דקות ולבדוק את הג'ל תחת אור UV.
בפרוטוקול זה, שני RNAs מדריך כי לאגף את המוטנט Exon23 תוכננו. לאחר הפסקות דו-גדיליות מתווכו Cas9 והצטרפות סוף לא הומולוגית, מוטציה Exon23 נמחק, המאפשר ייצור דיסטרופין קטום אך פונקציונלי. כדי למנוע את הדליפה של פתרון טריפסין, אנחנו צריכים להחיל גריז באופן שווה על החלק התחתון של הטבעות.
השילוב של עריכת גנום CRISPR/Cas9 עם מערכת הפעלה מונעת של MyoD מספק אסטרטגיה בטוחה, אפשרית ויעילה להשתלה אוטולוגית בחולים ניוון שרירים דושן עם תאי האב הבסיסי התאוששות גנים.
