שיטה זו מנסה לתאר שלוש שיטות נפוצות להערכת ההגירה של נויטרופילים נורמליים ב vivo ו במבחנה, כמו גם חדירה של נויטרופילים פתולוגיים במודל דלקת פרקים העכבר. אנו חושבים כי שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור חוקרים אחרים בתחום זה. פרוטוקול זה מכיל את הפרטים המתודולוגיים כדי להעריך את יכולת הנדידה של נויטרופילים באתרי הדלקת באמצעות מראי כיס אוויר ודלקת פרקים הנגרמת על ידי עורך דם.
ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי טיפול דלקת פרקים על ידי השוואת קבוצת המודל עם קבוצת הטיפול. שיטה זו יכולה לספק תובנה למחלות דלקתיות ו ניתן ליישם אותה על מחלות מעי דלקתיות. הדגמת ההליך תהיה צ'ינגיי לו והאיקסו ג'יאנג, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלנו.
לאחר הרדמה של העכברים ביום אפס, השתמש במסנן 0.22 מיקרון המחובר למזרק חמישה מיליליטר כדי להשיג נפח של שלושה מיליליטר של אוויר מעוקר. הרם את העור האחורי של העכבר הרדמה עם פינצטה ו subcutaneously להשתמש 26 מד על ידי 3/8 אינץ מחט כדי להזריק שלושה מיליליטר של האוויר מעקר. לאחר הטיפול, מוציאים את העכברים מיחידה הנשימה ומ מניחים אותם בכלוב מוגדר היטב.
לפקח על העכברים כדי להבטיח שהם בחיים עד שהם מתחילים לנוע. ביום השלישי, הזרקת שלושה מיליליטר נוספים של אוויר מעוקר לכיס האוויר שהוקם בעבר כדי לקיים את כיס האוויר. ביום השישי, להזריק טיפולים שונים לתוך כיס האוויר.
להזריק מיליליטר אחד של PBS כשליטה שלילית ולהזריק מיליליטר אחד של מיקרוגרם אחד לכל LPS מיליליטר כשליטה חיובית כדי לגרום לדלקת מקומית. אחרי שש שעות, להקריב את העכברים. עבור כל כיס אוויר, להזריק מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לשטוף את כיס האוויר ולאסוף את exudate דלקתי בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
ואז לשטוף את כיס האוויר עם שני מיליליטר של חיץ לשטוף פעמיים ולאסוף את exudate דלקתי באותו צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 100 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים במיליליטר אחד של חיץ שטיפה.
לספור את התאים כדי לכמת את יחס נויטרופילים באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי. להשעות את העוון של פרוינד להשלים על ידי מערבולת לפחות חמש שניות, ולאחר מכן לצייר 100 microliters של השעיה לתוך מזרק אינסולין. לאחר הרדמה, לסמן את הכף שנבחרה ולהזריק 20 microliters של תוסף שלם פרוינד מן המזרק לארבעה כתמים periarticular על שטח מפרק הקרסול.
שים את העכברים המעובדים בתא החדש. לפקח על העכברים כדי להבטיח שהם נושמים עד שהם להחזיר את היכולת לנוע. כל שלושה ימים, השתמש במד עובי כיס כדי למדוד את קוטר מפרק הקרסול.
כמו כן, להעריך את חומרת דלקת פרקים על ידי דלקת פרקים קריטריון ניקוד. אפס זה נורמלי. אין עדות לאריתמה ונפיחות.
אחת מהן היא דלקת פרקים קלה ביותר. אריתמה ונפיחות קלה מוגבלים לטארזלים או למפרק הקרסול. שתיים היא דלקת פרקים מתונה.
אריתמה ונפיחות קלה המשתרעת מהקרסול אל הזפתים. שלוש היא דלקת פרקים חמורה. אריתמה ונפיחות מתונה המשתרעת מהקרסול למפרקים מטא-מטרסלים.
ארבע היא דלקת פרקים החמורה ביותר. אריתמה ונפיחות חמורה מקיפות את הקרסול, כף הרגל והספרות, או אקילוזיס של האיבר. לאחר הקרבת העכבר, להסיר את העור וחלק השריר מהרגל האחורית עם פינצטה ומספריים.
מרססים את המפרק ב-70% אתנול ומסירים את שאר השרירים באמצעות מגבת נייר. תקן את מפרק הקרסול בפרפורמלדהיד 4% במשך יומיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מדקים את המפרק ב-10%EDTA למשך חודש בטמפרטורת החדר ומנים את המדיום מדי שבוע.
לאחר חודש אחד, מניחים את הרקמה בתבנית מסומנת עם נפח מסוים של פרפין נוזלי בערך 60 מעלות צלזיוס כדי להטמיע את הרקמה. מגניב בקצרה. מניחים את העובי על המיקרוטום על ארבעה מיקרומטר וחותכים פרוסות.
ואז לצוף את החלקים באמבט מים 43 מעלות צלזיוס לזמן קצר כדי להרחיב את החלקים. הר את החלקים על מגלשות והכניס את המגלשות לתנור בטמפרטורה של 70 מעלות במשך שעתיים. לשימוש עתידי, לחסוך את השקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, מניחים את המגלשות במדף ומבצעים שטיפות בקסילן ואתנול על פי כתב היד כדי להתייבש בטמפרטורת החדר. לבסוף, לשטוף במי ברז זורמים במשך שלוש דקות. לאחר מכן הכתימו בתסרון ירוק מהיר של 0.1% למשך חמש דקות.
יש לשטוף 1% חומצה אצטית למשך 10 שניות ולהכתים ב-0.1%Safranin O במשך 20 דקות. לאחר מכן, לטבול את השקופיות קסילן ואתנול שטיפת פתרונות על פי כתב היד. הר את חלקי הרקמה על שלב האובייקט והתבונן ברקמות תחת מיקרוסקופ.
כדי לדמיין נויטרופילים, לבצע כתמים אימונוהיסטוכימיים על ידי אפיית הראשון את חלקי הפרפין במשך שעתיים ב 78 מעלות צלזיוס. מניחים את המגלשות במדף ומבצעים את הקסילן, האתנול, המים וה- PBS נשטפים בהתאם לכתב היד כדי להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להוסיף טיפה אחת של חיץ permeabilization כדי לכסות את הרקמה.
הדגירה את החלקים במגש מבוקר לחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. הימנע שטיפת הרקמה ישירות.
לאחר מכן, לבצע אחזור אפיטופ אנטיגן הנגרמת על ידי חום. סדר את השקופיות בארון תקשורת. לטבול את השקופיות דוד הלחץ מלא מאגר אחזור.
מכניסים את דוד הלחץ למיקרוגל ומניחים את המיקרוגל על 600 וואט ומחממים את המגלשות במשך 10 דקות. לאחר הרתיחה, לשמור את השקופיות הדוד להתקרר עד 90 מעלות צלזיוס. מוציאים את השקופיות ושטיפתן ב-PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים.
כדי להתרווה פעילות פרוקסידזה אנדוגנית, לטבול את השקופיות ב 3% מי חמצן טרי מוכן בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. שטפו שקופיות ב-PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. מתאר עיגול גדול סביב המדגם עם עט הידרופובי.
הימנע מנגיעה בדגימה. הוסיפו לדגימה 50 עד 100 מיקרוליטרים של אלבומין סרום 3%bovine כדי לחסום ולמקם את הדגימות בתא מבוקר לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן הסר את פתרון החסימה.
הוסף 50 microliters של PBS מדולל נוגדן ראשוני לכל סעיף במהירות. הדגירה את המגלשות במגש מבוקר לחות בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום השני, להוציא את המגש ולתת לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
לאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. הוסף 50 microliters של PBS מדולל נוגדנים משניים לרקמות. הדגירה מחליקה במגש מבוקר לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. לפתח פתרון DAB מדולל במשך חמש דקות. הימנע מהתפתחות של צבע כהה שנגרם על ידי תומרת יתר של DAB.
שוטפים את המגלשות במים מזוקקים. יש לנטרל את השקופיות בהמטוקסילין למשך 10 שניות ולשטוף את השקופיות במי ברז למשך חמש דקות. יש לשטוף באלכוהול חומצי בתתברואה מהירה במיוחד למשך שלוש שניות, ולאחר מכן לשטוף במי ברז למשך 10 דקות.
לטבול את המגלשות באתנול וקצילן שוטף בטמפרטורת החדר על פי כתב היד. תקן את המכסה עם פתרון הרכבה. שימו לב לרקמה מתחת למיקרוסקופ.
במחקר זה, ניסויים שקית אוויר בוצעו כדי לחקור את גיוס נויטרופילים מגורה על ידי LPS ב vivo. קבוצות המשנה של לויוצ'יט בכריות האוויר היו גבוהות בהרבה מאשר בשליטה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, קבוצת דלקת פרקים הנגרמת על ידי edjuvant הראתה בצקת משמעותית בכפות הרגליים.
קוטר מפרק הקרסול עלה וציון דלקת פרקים עלה באופן עקבי. נזק לסחוס הוא התסמונת הייצוגית של דלקת מפרקים שגרונית. אתגר CFA גרם כמות גדולה של חדירת לויקוציט, שחיקת סחוס משמעותית, היפרפלזיה סינוביאלית.
MPO בכל רמות ביטוי הם סמנים מייצגים של חדירת נויטרופילים אשר היו מוסדר באופן משמעותי בסעיף המשותף. ודא כי האוויר מוזרק לתוך העור, אבל לא לתוך השריר. אנחנו יכולים גם לחקור את היווצרות של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיים של חלקי רקמת מפרק הקרסול עם אנטי p84 או שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לחקור מחלות דלקתיות אחרות כגון מחלות מעי דלקתיות.
