هذه الطريقة تحاول وصف ثلاث طرق تستخدم بشكل متكرر لتقييم هجرة العدلات العادية في الجسم الحي وفي المختبر وكذلك تسلل العدلات المرضية في نموذج التهاب المفاصل الماوس. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة يمكن أن تكون مفيدة للباحثين الآخرين في هذا المجال. يحتوي هذا البروتوكول على التفاصيل المنهجية لتقييم قدرة الهجرة من العدلات في مواقع الالتهاب باستخدام مقايسة الحقيبة الهوائية والتهاب المفاصل المستحث.
الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو علاج التهاب المفاصل من خلال مقارنة المجموعة النموذجية مع مجموعة العلاج. هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الأمراض الالتهابية ويمكن تطبيقها على مرض التهاب الأمعاء. وسوف يكون إثبات الإجراء تشينغي لو وهايكو جيانغ، طلاب الدراسات العليا من مختبرنا.
بعد تخدير الفئران في اليوم صفر، استخدم فلتر 0.22 ميكرون تعلق على حقنة خمسة ملليلتر للحصول على حجم ثلاثة ملليلتر من الهواء المعقم. رفع الجلد الخلفي من الفأر تخدير مع ملاقط واستخدام تحت الجلد قياس 26 من قبل 3/8 إبرة بوصة لحقن ثلاثة ملليلترات من الهواء تعقيم. بعد العلاج ، قم بإزالة الفئران من وحدة التنفس ووضعها في قفص جيد.
مراقبة الفئران لضمان أنها على قيد الحياة حتى تبدأ في التحرك. وفي اليوم الثالث، حقن ثلاثة ملليلترات إضافية من الهواء المعقم في الجيب الجوي الذي سبق إنشاؤه للحفاظ على الحقيبة الهوائية. في اليوم السادس، تحقن علاجات مختلفة في الحقيبة الهوائية.
حقن ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني كتحكم سلبي وحقن ملليلتر واحد من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر LPS كتحكم إيجابي للحث على التهاب المحلية. بعد ست ساعات، ضحي بالفئران لكل حقيبة هوائية، تحقن مليلتراً واحداً من عازلة الغسيل لغسل الحقيبة الهوائية وجمع الناضحات الالتهابية في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر.
ثم غسل الحقيبة الهوائية مع مليلترين من العازلة غسل مرتين وجمع نضح التهاب في نفس أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 100 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من غسل العازلة.
عد الخلايا لتحديد نسبة العدلات باستخدام محلل أمراض الدم التلقائي. تعليق كامل فريوند مساعد من خلال دوامة ما لا يقل عن خمس ثوان، ثم رسم 100 ميكرولترات من التعليق في حاقن الأنسولين. بعد تخدير, علامة مخلب المختار وحقن 20 microliters من مساعد فرويند كاملة من حاقن في أربع بقع حولية على مساحة مفصل الكاحل.
ضع الفئران المعالجة في الغرفة الجديدة مراقبة الفئران للتأكد من أنها تتنفس حتى أنها استعادة القدرة على التحرك. كل ثلاثة أيام، واستخدام مقياس سمك الجيب لقياس قطر مفصل الكاحل.
أيضا، تقييم شدة التهاب المفاصل من قبل معيار تسجيل التهاب المفاصل. الصفر طبيعي لا يوجد دليل على الحمامي والتورم.
واحد هو التهاب المفاصل الاخف. اريثيما وتورم خفيف محصور في التارسال أو مفصل الكاحل. اثنان هو التهاب المفاصل المعتدل.
اريثيما وتورم خفيف يمتد من الكاحل إلى التارسال. ثلاثة هو التهاب المفاصل الحاد. Erythema وتورم معتدل تمتد من الكاحل إلى المفاصل مشط القدم.
أربعة هو التهاب المفاصل الأكثر شدة. الحمامي وتورم شديد تشمل الكاحل, قدم, والأرقام, أو ankylosis من الطرف. بعد التضحية بالماوس، قم بإزالة الجلد وجزء من العضلات من الساق الخلفية باستخدام الملاقط والمقص.
رش المفصل مع 70٪ الإيثانول وإزالة بقية العضلات باستخدام منشفة ورقية. إصلاح مفصل الكاحل في 4٪ شبهformaldehyde لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة. ثم decalcify المشترك في 10٪ EDTA لمدة شهر واحد في درجة حرارة الغرفة وتغيير متوسط أسبوعيا.
بعد شهر واحد، ضع الأنسجة في قالب ملحوظ مع حجم معين من البارافين السائل في حوالي 60 درجة مئوية لتضمين الأنسجة. بارد لفترة وجيزة. تعيين سمك على microtome في أربعة ميكرومتر وقطع شرائح.
ثم تعويم المقاطع في حمام مائي 43 درجة مئوية لفترة قصيرة لتوسيع المقاطع. جبل المقاطع على الشرائح ووضع الشرائح في الفرن في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. للاستخدام في المستقبل، والحفاظ على الشرائح في ناقص 20 درجة مئوية.
بعد ذلك، ضع الشرائح في رف وأجر الغسلات في الزيلين والإيثانول وفقًا للمخطوطة لإعادة الترطيب في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، يغسل في مياه الصنبور الجارية لمدة ثلاث دقائق. ثم وصمة عار في 0.1٪ حل أخضر سريع لمدة خمس دقائق.
شطف في 1٪ حمض الخليك لمدة 10 ثوان وصمة عار في 0.1٪ صفرارنين O تلطيخ حل لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، غمر الشرائح في محلولي غسل الزيلين والإيثانول وفقا للمخطوطة. جبل أقسام الأنسجة على مرحلة الكائن ومراقبة الأنسجة تحت المجهر.
لتصور العدلات، أداء التلطخ الكيميائي المناعي عن طريق الخبز أولا أقسام البارافين لمدة ساعتين في 78 درجة مئوية. ضع الشرائح في رف وأجر الزيلين والإيثانول والماء وبساح PBS وفقًا للمخطوطة لإعادة الترطيب في درجة حرارة الغرفة. ثم إضافة قطرة واحدة من عازلة permeabilization لتغطية الأنسجة.
احتضان المقاطع في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. تجنب شطف الأنسجة مباشرة.
بعد ذلك، تنفيذ المستضد الناجم عن الحرارة استرجاع epitope. ترتيب الشرائح في رف. غمر الشرائح في المرجل الضغط مليئة المخزن المؤقت للاسترجاع.
ضعي غلاية الضغط في فرن الميكروويف واضبطي فرن الميكروويف على 600 واط واسخني الشرائح لمدة 10 دقائق. بعد الغليان، والحفاظ على الشرائح في المرجل لتبرد إلى 90 درجة مئوية. أخرج الشرائح وشطفها في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات.
إخماد نشاط البيروكسيديز الذاتية، غمر الشرائح في إعداد حديثا 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. مخطط دائرة كبيرة حول العينة مع قلم مبيد للماء.
تجنب لمس العينة. إضافة على عينة 50 إلى 100 ميكرولترات من 3٪ البوم مصل البقر لمنع ووضع العينات في غرفة الرطوبة التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم قم بإزالة حل الحظر.
أضف 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة لبرنامج تلفزيوني إلى كل قسم بسرعة. احتضان الشرائح في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثاني، أخرج الدرج واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ثم شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. إضافة 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة. يحتضن الشرائح في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ثم شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. تطوير في محلول DAB المخفف لمدة خمس دقائق. تجنب تطور لون داكن بسبب رد الفعل المفرط للـ DAB.
شطف الشرائح في الماء المقطر. قم بـ Counterstain الشرائح في الهماوكسيلين لمدة 10 ثوان واشطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة خمس دقائق. شطف في حمض الكحول سوبر حل التمايز السريع لمدة ثلاث ثوان، ثم شطف في مياه الصنبور لمدة 10 دقائق.
اغمر الشرائح في الإيثانول ويغسل الزيلين في درجة حرارة الغرفة وفقًا للمخطوطة. إصلاح الغطاء مع حل تصاعد. مراقبة الأنسجة تحت المجهر.
في هذه الدراسة، أجريت تجارب الحقيبة الهوائية للتحقيق في تجنيد العدلات التي حفزت عليها LPS في الجسم الحي. وكانت المجموعات الفرعية الكريات البيض في الحقيبة الهوائية exudates أعلى بكثير مما كانت عليه في السيطرة. بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، أظهرت مجموعة التهاب المفاصل المستحثة بـ adjuvant وذمة كبيرة في مخلب.
زاد قطر مفصل الكاحل وارتفع نتيجة التهاب المفاصل باستمرار. تلف الغضاريف هو المتلازمة التمثيلية لالتهاب المفاصل الروماتويدي. تسبب التحدي CFA كمية كبيرة من تسلل الكريات البيض، وتآكل الغضاريف الكبيرة، وتضخم الزلق الزليلي.
MPO في أي مستويات التعبير هي علامات تمثيلية لتسلل العدلات التي كانت مُنَتَكَّلة بشكل ملحوظ في القسم المشترك. تأكد من حقن الهواء في الجلد، ولكن ليس في العضلات. يمكننا أيضا التحقيق في تشكيل الفخاخ خارج الخلية العدلات عن طريق التلطيخ المناعية الكيميائية من أقسام أنسجة الكاحل المشتركة مع المضادة p84 أو هذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة الأمراض الالتهابية الأخرى مثل مرض التهاب الأمعاء.
