אנו מודים לד&quot;ר קרל היינץ קראוזה ווינסנט ג&#39;וקס לעזרה וייעוץ להקמת פרוטוקולים אלה, וגם להודות כריסטוף באואר וג&#39;רום Bosset מפלטפורמת bioimaging של NCCR וד&quot;ר Navin Gopaldass לתמיכה הטכנית שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק ProDoc של שוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. ויזואליזציה ומדידה איכותית של ROS הייצור בPhagosomes צריכים להיות מוכנים חרוזים מצופים OBG מראש. נהלי ציפוי חרוזים וטכניקת כיסוי אגר מעובדים מאזכור פורסם 5,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של השעיה 3.0 מיקרומטר חרוזים carboxylated סיליקה (כ 1.8 x 10 9 חרוזים) לתוך צינור 1.5 מיליליטר, לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של PBS על ידי ספין וvortexing מהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של PBS המכיל 25 מ&quot;ג / מיליליטר cyanamide (כדי להפעיל את חרוזים סיליקה carboxylated לקוולנטית לאגד prelabeled BSA), דגירה על גלגלים ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ צימוד (0.1 borate M נתרן, pH 8.0) על ידי מהיר ספין (צנטריפוגות במלוא המהירות בצנטריפוגה מיני בראש הטבלה למשך 5 שניות או לחלופין צנטריפוגות XG ב 2000 דקות 1 בצנטריפוגה בראש טבלה) ו vortexing להסיר cyanamide העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את חרוזים נשטפו עם 500 μl של גoupling מאגר המכיל 1 מ&quot;ג של OxyBurst גרין (OBG) H2HFF (Dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, למלא את הצינור עם גז חנקן מגז יכול סטנדרטי לפני הסגירה, ו לדגור על גלגלים ל14 שעה (לילה) בשעה RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החרוזים 2x עם 1 מיליליטר של מרווה חיץ (250 מ&quot;מ glycin PBS) כדי להסיר OBG unreacted, ופעמים עם חיץ צימוד כדי להסיר את חיץ מרווה ידי ספין וvortexing מהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ צימוד המכיל 50 מיקרוגרם של אסתר 594 succinimidyl אלקסה פלואוריד כדי להטות לארגון ה-BSA. מלא את הצינור עם חנקן לפני הסגירה, ולדגור על גלגלים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של מרווה חיץ ידי ספין וvortexing כדי לעצור את התגובה מהיר, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של PBS על ידי ספין וvortexing מהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של PBS עם 2 μl של 10% w / v אזיד עבור אחסון לטווח ארוך. מדוד את concentration של חרוזים בהשעיה עם hemocytometer (בדרך כלל סביב 1-2 x 10 9 חרוזים / ml), למלא את הצינור עם חנקן לפני הסגירה, ולאחסן ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעילות הציפוי של העמסת OBG ניתן לבדוק על ידי בדיקת ספקטרום הפליטה באמצעות עירור ב500 ננומטר. כאשר חמצון על ידי H 2 O 2 בנוכחות חזרת peroxidase (HRP), עוצמת הקרינה של חרוזים חמצון, בשיא פליטה (538 ננומטר), היא גבוהה יותר 11-12x יותר מזה של חרוזים מצופים nonoxidized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקציר גדל באופן אקספוננציאלי תאי Dictyostelium מצלחת פטרי 10 סנטימטר, צלחת צפיפויות שונות של תאים על 3 מנות סנטימטר עם פלסטיק ברור אופטי או בתחתית כוס, ולגדל אותם בין לילה. בחר את המנות שהן מחוברות% על 80 לצורך הניסוי. פרוטוקול מפורט לטיפוח תאי Dictyostelium כבר פורסם 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם מדיום LoFlo (בינוני LF), דגירה של2 שעות לפני הניסוי על מנת להקטין את autofluorescence תאי וintraendosomal של מדיום תרבות HL5C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, להמס 10 מיליליטר 1.5% אגר bacto במדיום LF, יוצק אגר על גבי משטח שטוח (כלומר צלחת זכוכית של 10 סנטימטר x 10 סנטימטר) כדי ליצור שכבה אגר על 1 מ&quot;מ עובי, להמתין ל10-15 דקות כדי לחזק. חותכים את השכבה אגר לתוך 2 ס&quot;מ X 2 סנטימטר ריבועים ומקום במדיום LF לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין את ספינינג הדיסק או מיקרוסקופ שדה רחב, לקבוע את הטמפרטורה של החדר הסביבתי ב22 ° C ולהתאים את ההגדרות לניסוי זה. (ראה הערות נוספות בדיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות של דגירה, לשאוב את מדיום LF מצלחת 3 סנטימטר, אבל monolayer התא עדיין צריך להיות מכוסה על ידי שכבה דקה של מדיום. לדלל את חרוזים מצופים ל1.5 x 10 7 מיליליטר / חרוזים, ולהוסיף 10 μl על שכבת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח גיליון אגר מרובע אחד, ניקוז נוזל עודף אבל לשמור על רטוב. בעדינות לשים את הכיכר אגר דואר על גבי שכבת התאים. אל תזיז את הכיכר אגר כאשר הוא שוכב על התאים. הכיסוי אגר משמש להגברת קשר בין חרוזים ותאים, ובכך לשפר את הספיגה, וזה גם מעט דוחס את התאים, שמירה טובה יותר להם במישור המוקד של המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכסה על הצלחת, מניח אותו על הבמה מיקרוסקופ, ובאופן אוטומטי לצלם בערוצים האדומים, ירוק ושלב כל 1 דקות לשעה 2 או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהתמקד באירועים סלולריים המכילים את כל התהליך של phagocytosis. מיזוג 3 הערוצים מותאמים ולהרכיב את התמונות לסרט באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מקצועית. לכמת עוצמות הקרינה של כל חרוזים שנבחרו בערוצים אדומים וירוקים, והיחס ירוק / אדום ישקף את ייצור ROS phagosomal הדינמי של התאים. </li></ol> 2. מדידת תפוקה בינונית כמותי ושל תאית Superoxide הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף one 80% צלחת ומחוברות של Dictyostelium ב10 מיליליטר של מדיום HL5C. צנטריפוגה תאי Dictyostelium ב850 XG במשך 5 דקות, בזהירות ובינוני עודפים לשאוב לחלוטין. תאי resuspend במאגר SS6.4 [0.12 M סורביטול במאגר סורנסן (14.69 מ&quot;מ KH 2 PO 4 ו6.27 מ&quot;מ Na 2 HPO 4), pH 6.4], לספור תאים ו לדלל את צפיפות סופית של 6 x 10 6 תאים / מיליליטר (ראה הערות נוספות בדיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של השעיה תא לתוך באר כל צלחת לא שקופה לבנה 96 היטב (ראה הערות נוספות בדיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מניות DHE (30 מ&quot;מ DMSO) קיפול 500 עם SS6.4, פיפטה 50 μl של DHE המדולל לזה גם בעזרת פיפטה רבה במידת צורך. הריכוז הסופי של DHE הוא 30 מיקרומטר. התגובה מתחילה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להוסיף גירויים או מעכבים, בשלב זה, או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסופו של דבר הנקודה &quot;ראש הקריאה &amp; #34; מצב של קורא microplate הקרינה, עם עירור הקרינה / פליטה ב522 ננומטר nm/605, לקרוא כל 2 דקות לשעה 1, לנער בינוני 5 שניות / דקות, על 22 ° C. </li></ol> 3. הפקת H כמותי ותפוקה גבוהה מדידה של תאי 2 O 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים כפי שתואר ב2.1 ו2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HRP המדולל על ידי הוספת 5 μl של מניית HRP (100 U / ml במים מזוקקים) ל10 מיליליטר של SS6.4, מערבולת או להפוך את הצינור לערבב היטב ולשמור על קרח לשימוש מאוחר יותר. פתרון HRP בדילול מלא הוא ב0.05 U / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת תגובת AUR ידי ערבוב מניית AUR (10 מ&quot;מ AUR DMSO) ופתרון HRP המדולל למאגר SS6.4 לריכוזים הסופיים של 6.25 מיקרומטר, ו0.005 U / ml, בהתאמה. כדוגמא, כדי להכין את תערובת התגובה ל40 תגובות, לערבב 1600 μl של SS6.4 עם 400 μl של HRP בדילול מלא ו2.5 μl של פתרון מניות AUR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl תמהיל AURture לזה גם בעזרת פיפטה רבה במידת צורך. עכשיו מתחילה להיוצר התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להוסיף גירויים או מעכבים, בשלב זה, או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב נקודת הסיום &quot;הקריאה הראשונה&quot; של קורא צלחת מיקרו הקרינה, עם עירור הקרינה / פליטה ב530 nm/590 ננומטר, לקרוא כל 2 דקות לשעה 1, לנער בינוני 5 שניות / דקות, על 22 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בהשוואה לשיטות שתוארו קודם לכן, assay OBG דינמי מדמיין את התהליך של יצירת ROS phagosomal ברמת התא הבודד, במקום למדוד אות ROS ממוצעת מאוכלוסייה של תאים. שיטות אוכלוסיית מיצוע כאלה נוטים לטשטש מידע קריטי הנגרם על ידי phagocytosis nonsynchronous. אנחנו הסתגלנו בהצלחה מבחני DHE וAUR לDictyostelium ומ?...

מיני חמצן תגובתי (ROS) מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת מארחת, איתות, פיתוח רקמות ותגובה לפציעה, כמו גם יתר לחץ דם וסרטן. מכונות מונואמין NADPH phagosomal למדו היטב מוקדשת לדור ROS המהיר, המכונה פרץ חמצוני, כדי להרוג חיידקי בלע בphagosomes &#39;נויטרופילים 1. בנוסף, זליגה של אלקטרונים כתוצר לוואי של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה חשבה בעבר להיות אחראי אך ורק למקור ללא פיקוח של ROS. אבל לאחרונה, זה זוהה כמנגנון חשוב לתרום להרג intraphagosomal של חיידקים במקרופאגים עכבר 2. בשנים האחרונות, האמבה החברתית, Dictyostelium, הפכה למודל רב עוצמה והפופולרי ללמוד מנגנונים פנימיים תא של תגובת החיסון המולדת. ואכן, Dictyostelium וphagocytes האנושי לשתף ברמה גבוהה באופן מפתיע של שימור בmoleculaמנגנונים r אחראים לחיידקים חישה, היבלעות והרג 3,4. Homologs של חלבונים ואנזימים הקשורים לייצור ROS או סילוק רעלים, כגון oxidases NADPH, catalases, dismutases סופראוקסיד, ניתן למצוא בשני בני אדם וDictyostelium. כמו האמבה למדה הטוב ביותר, Dictyostelium מציג מספר יתרונות ייחודיים על פני מערכת מודל של יונקים. הם גדלים בטמפרטורת חדר ללא הצורך בCO 2, עם זמן הכפלה של 8-10 לשעה. הם יכולים להיות כל הזמן בקלות כמו תרבויות חסיד או השעיה. בנוסף, הודות להגנום הפלואידים הרצף מלא והמבואר שלהם, ולמניפולציה גנטית קלה, Dictyostelium הפך אורגניזם מודל ניסיוני מאוד אטרקטיבי. במחקרים קודמים, נגזרים כלור ופלואור שונים של ההעמסה (הידועה קולקטיבי OxyBurst גרין, OBG) שפולט הקרינה לאחר חמצון על ידי ROS, שימש ככתב ROS. est Cell-permeantנגזרי erified משמשים למדידת ROS cytoplasmic, ואילו או dextran-נגזרי תא impermeant-חלבון בשילוב משמשים למדידת ROS תאי. בפרט, חרוזים מצופים BSA OBG כבר נעשו שימוש כדי לזהות ייצור ROS phagosomal בתאי יונקים 5. עם זאת, הגישה המבוססת על קורא microplate יכולה רק לתת עקומת דור ROS בממוצע מאוכלוסייה של תאים. עם הפרוטוקול הנוכחי, באמצעות Dictyostelium, תא בלען מקצועי, ותנאי ניסוי מותאמים, אנו מקבלים phagocytosis היציב והיעיל מבלי להטות כל opsonin על חרוזים. DHE נעשה שימוש במערכות שונות מודל, כגון נויטרופילים ומקרופאגים יונקים, כדי לזהות ייצור ROS 6-9. בינתיים, יש כמה מחלוקות על הסגוליות והרגישות של 8,10 השיטה. כמו גרסה משופרת של Amplex אדום, עוצמת הקרינה של AUR הוא פחות רגיש לחומציות, מה שהופך אותו מתאימים יותר למדידהROS בחוגי nonneutral או חומצי חלש. AUR הוחל לאחרונה במספר מערכות של יונקים 11,12, אך השימוש בו בדגמי nonmammalian, אשר לעתים קרובות דורשים תקשורת צמיחת חומצי חלש, לא דווח עד כה. בנוסף, אין פרוטוקול שפורסם כמותית ודינמית למדידת ייצור ROS ולוקליזציה באמבה החברתית Dictyostelium. המטרה של הקבוצה של פרוטוקולים שהוצגה היא לספק פתרון קל ותכליתי כדי לפקח ROS שונים והלוקליזציה שלהם, ועוד יותר לתת תובנות מנגנונים תאיים הקשורים ל-ROS. עבור assay OBG, השתמשנו במיקרוסקופ חי כדי לפקח על כל התהליך של דור ROS phagosomal לאחר הספיגה של חרוזים מצופים OBG ידי תאי Dictyostelium, וסיפק גישה חדשה כדי ללמוד את מנגנון הרג intraphagosomal של חיידקים. יש לנו אופטימיזציה מבחני DHE וAUR בינוני תפוקה בDictyostelium, למדוד superox תאיתIDE ו-H 2 O 2 תאי ייצור, בהתאמה, על ידי שימוש בLPS כממריץ ROS חזק. שים לב שLPS הוצג לאחרונה על הגדלת פעילות bactericidal של Dictyostelium כלפי חיידקי phagocytosed 13. בנוסף, הטיפול בDEDTC וקטלאז במפורש אישר כי שתי השיטות הללו באופן ספציפי למדוד סוגים שונים ומגויר subcellular של ROS בDictyostelium. לבסוף, assay OBG יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic חסיד, על ידי opsonizing נוסף חרוזים עם ligands לקולטנים phagocytic של תאי חיים. באופן עקרוני, מבחני DHE וAUR יכולים להיות גם למדידות בכל תא חסיד או nonadherent תחת תנאי ניסוי מתאימים מכויל.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

מיני חמצן תגובתי (ROS) מהווים מגוון של מולקולות וקצרות מועד, המכיל חמצן, שהם באופן דינמי interconverted או בוטלו או catalytically או באופן ספונטני. בשל אורך חיים הקצר של רוב ROS והגיוון של מקורותיהם והמגוירים subcellular, ניתן לקבל תמונה שלמה רק על ידי מדידות מדוקדקות באמצעות שילוב של פרוטוקולים. כאן, אנו מציגים סט של שלושה פרוטוקולים שונים באמצעות OxyBurst גרין (OBG) מצופה חרוזים, או dihydroethidium (DHE) וAmplex UltraRed (AUR), כדי לפקח איכותי וכמותית ROS השונים בphagocytes המקצועי כגון Dictyostelium. אנו מותאמים נהלי חרוזים ציפוי וחרוזים מצופים OBG משומשים ומיקרוסקופיה חיות לדמיין דור ROS intraphagosomal דינמי ברמת התא הבודד. זיהינו lipopolysaccharide (LPS) מE. coli כממריץ רב עוצמה לייצור ROS בDictyostelium. בנוסף, אנו דזמן אמת eveloped, מבחני בינוני תפוקה באמצעות DHE וAUR למדוד באופן כמו סופראוקסיד תאיים ו-H 2 O 2 תאי ייצור, בהתאמה.

הדור של ROS בphagosomes ניתן דמיינו איכותי ודינמי על ידי מיקרוסקופ (S1 קובץ). הקרינה האדומה הנפלטת על ידי Alexa פלואוריד 594 היא pH-רגיש ונשאר קבוע בסביבת phagosomal, בעוד חמצון של OBG מגביר הקרינה שלו במסלול הירוק. ספקטרום הפליטה של במבחנה מתחמצן וחרוזים מצופים OBG nonoxidized מו...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  University of Geneva.  מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים. 

Video: Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית