פרוטוקול שלב אחר שלב זה מראה כיצד לזהות ולאפיין באופן פונקציונלי את הפעילות האנזימטית של רצועות U3 בכל מקום מסוג RING, הן במבחנה והן בצמחייה, באמצעות גישת מוטגנזיס מכוונת אתר. על ידי החדרת מוטציה בתחום RING באמצעות mutagenesis מכוונת האתר, מוטציה E3 לקוי וכתוצאה מכך ניתן לבדוק במקביל חלבון מסוג בר כדי לקשר את הפעילות האנזימטית עם פונקציונליות. הבנת הבסיס הביוכימי והמכני של רצועות אוביקיטין מסוג RING E3 יכולה לתרום רבות להבנת חשיבותן הביולוגית בפיתוח, איתות מתח ותחזוקה של הוימוסתזיס.
עם שינוי קל של מערכת הביטוי in vivo, ניתן להחיל פרוטוקול זה על הניתוח של כל ליגה E3 מסוג RING ללא קשר למקורו. התחל בזיהוי Cys שמורות וחומצות האמינו שלו בתחום RING ועיצוב פריימרים הנושאים את קודון ההחלפה של עניין מוקף 15 זוגות בסיס משני צדי אתר המוטציה. זה קריטי כדי לזהות כראוי את תחום RING, במיוחד שאריות ציסטאין והיסטידין שמורות שלה.
ניתן להשתמש בכלים מקוונים כגון PROSITE לשם כך. השתמש פריימרים mutagenic בהגברת PCR כדי להציג את המוטציה הרצויה לתוך פלסמיד מחסה הגן של עניין, הקפד להשתמש פולימראז DNA נאמנות גבוהה, כגון Pfu. לאחר PCR, לעכל את E.coli נגזר הורים מתילציה ו- DNA מתילציה למחצה על ידי הוספת שלושה microliters של אנזים הגבלת Dpnl ישירות לתגובת PCR ודגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לטהר את פלסמידים mutagenized עם ערכת מיצוי DNA מסחרי, ולחמק DNA ב 50 microliters של מים. לאחר מכן, להפוך את DH5-אלפא E.coli תאים מוכשרים כימית עם 0.5 microliters של DNA פלסמיד mutagenized התאושש על פי פרוטוקול היצרן. שיבוט טבעת מסוג פראי וגנים טבעת מוטציה של עניין לתוך וקטור pMAL-c2 כדי להתיך גנים אלה עם תג epitope MBP.
לאחר מכן, להגדיר את התגובה במבחנה בכל מקום בנפח כולל של 30 microliters, כמתואר בכתב היד, ולהדרגר את התערובת ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לסיים את התגובה על ידי ערבוב המדגם עם 7.5 microliters של חיץ טעינה 5x SDS-PAGE ומרתיח אותו במשך חמש דקות, ולאחר מכן להפריד את החלבונים עם 7.5% SDS-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה. העבר אל קרום PVDF, ולזהות את בכל מקום עם כתמים מערביים ואנטי-דגל.
הכתם את הממברנה בכחול קומאסי כדי לאמת את הטעינה השווה של חלבון מסוג MBP-RING שנבדק. פס זני tumefaciens אגרובקטריום נושאת את הגן מתויג epitope של עניין על מדיום LB המכיל את אנטיביוטיקה הבחירה המתאימה. לאחר יומיים של צמיחה ב 28 מעלות צלזיוס, לבחור מושבות בודדות, ולגדל אותם במדיום נוזלי LB עם אנטיביוטיקה ב 28 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד במשך 24 שעות נוספות.
להעביר 100 microliters של תרבות אגרובקטריאלית לשלושה מיליליטר של LB טרי עם אנטיביוטיקה, ולהדגיר את התרבות במשך ארבע עד שש שעות נוספות. לסובב את התאים ב 1, 800 פעמים גרם במשך שש דקות, להשליך את supernatant, ו resuspend התאים עם שלושה מיליליטר של חיץ לשטוף. חזור על לשטוף פעמיים, ולאחר מכן resuspend התאים במאגר אינדוקציה, ו דגירה אותם במשך 10 עד 12 שעות נוספות ב 28 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה התאים ב 1, 800 פעמים גרם במשך שש דקות, ולהשליך את העל טבעי. השתמש מחדש את התאים עם שני מיליליטר של חיץ חדירה, ולקבוע את הריכוז של חיידקים באמצעות הערך OD600. Agroinfiltrate ארבעה שבועות Nicotiana benthamiana עלים על ידי דקירה בעדינות אותם עם מחט, ולהזריק יד אגרובקטריום עם מזרק, ואז להקיף את האזור הסתנן עם סמן.
לאחר 36 שעות, לאסוף את רקמת עלה הסתנן, ולטחון אותו לאבקה דקה עם חנקן נוזלי. יש למגר את אבקת הרקמה עם 300 מיקרוליטר של מאגר מיצוי חלבונים, ולקדם אותה ב-15,000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי, מוסיפים חיץ טעינה של 5x SDS-PAGE לריכוז סופי של פי 1 ומרתיחים את הדגימה במשך חמש דקות.
לאחר מכן, לבצע ניתוח כתם מערבי כדי לזהות פלנטה בכל מקום. פס המתאים זני tumefaciens אגרובקטריום נושאת גנים מתויגים של עניין או וקטור ריק, ולהזריק את האגרובקטריום על עלי Nicotiana benthamiana, כפי שתואר קודם לכן. עבור השפלת חלבון מצע תלוי E3, בצע את הפרוטוקול שתואר קודם לכן, ולבצע סופג מערבי עם נוגדנים מתאימים כדי לזהות הצטברות חלבון בתאי הצמח.
עבור עיכוב מוות תאי תלוי תגובה תלוי E3, לפקח על העלים agroinfiltrated לתסמיני מוות של תאים יומיים עד ארבעה ימים לאחר החדירה. תוצאת מבדיקה טיפוסית במבחנה מכילה מריחה מרובת band החל מהמשקל המולקולרי של החלבון שנבדק ומתקדמת כלפי מעלה. כצפוי, פקדים שליליים חסרים רכיבים בודדים או באמצעות MBP לא להדגים את האות מרוח.
יתר על כן, הכתם הכחול קומאסי של קרום PVDF הראה טעינה שווה של MBP-RHA1B או MBP בכל הפקדים. 11 E2s שונים נבדקו כדי לחקור כיצד בכל מקום במבחנה משתנה בהתאם לשילוב E2 עד E3 הספציפי. פעילות בכל מקום שזוהתה נעה בין שום אות למריחה מרובת סרטים החל במשקלים מולקולריים שונים, מה שמצביע על דפוסי בכל מקום שונים.
גרסאות המוטנטים RING-ו-K של RHA1B נבדקו לכל מקום במבחנה ובפלנטה. היעדר פעילות אנזימטית של גרסת מוטנט הטבעת נתמך על ידי חוסר היכולת שלה או ליצור מריחה מרובת סרטים במבחנה או לקדם אות פולי-בכל מקום ב planta. למרות אות עצמי שולי בכל מקום זוהה במבחנה עבור מוטציה K, רק בכל מקום רקע זוהה planta, מה שמרמז כי שאריות K146 הוא גם חיוני עבור פעילות E3.
שלא כמו RHA1B מסוג פראי, מוטנט הטבעת חסר פעילות ליגס E3 לא הפריע למוות תאי תגובה רגישות יתר. כתמים מערביים אישרו כי Gpa2 לא הצטבר בנוכחות RHA1B מסוג בר, אבל מוטציית הטבעת לא השפיעה על יציבות החלבון. בהתחשב בכך ששילוב E2-E3 תקין נחוץ לתגובת בכל מקום, יש לבצע בדיקות במבחנה במקביל לאנזימים E2 מרובים המייצגים מחלקות E2 שונות כדי למנוע תוצאות שליליות כוזבות.
מוטציה E3 ליגס לקוי מקל על הבדיקה של אינטראקציות אנזים-מצע ב vivo. יתר על כן, מוטציה זו מעניקה לעתים קרובות פנוטיפ שלילי דומיננטי שניתן לנצל במחקרי נוקאאוט תפקודיים כגישה חלופית ל- RNAi. באמצעות פרוטוקול זה, נמצא לאחרונה כי אפקט נמטודה RHA1B להפריע איתות חיסוני הצמח באופן תלוי E3 על ידי מיקוד הצמח Gpa2 immunoreceptor עבור בכל מקום השפלה.
