פרוטוקול זה מאפשר להעריך את יוביקוויטילציה של מצע מסוים על ידי ליגאז E3. אנו יודעים שהאפיון של אינטראקציית ליגאז-סובסטרט הוא חיוני להבנת תפקודם בתאים. טכניקה זו אינה דורשת ריאגנטים יקרים או ציוד מתוחכם.
הוא זקוק לפלסמידים ולקידוד הגנים המעניינים, פיתוח בדיקת אימונופרנציה עם ליזטים של תאים, וכתם מערבי כדי לזהות יוביקוויטילציה של מצע. מספר מחלות אנושיות כמו סרטן והפרעות נוירולוגיות קשורות לדיסרגולציה של ליגאז E3. לפיכך, זיהוי של יוביקוויטילציה של מצע על ידי ליגאז E3 ספציפי יכול לסייע בטיפול או באבחון של מחלות אלה.
הדגמת ההליך תהיה על ידי ולנטיין Spagnol. כדי להתחיל, להגדיל את קו תאי HEK293T ל-80 עד 90% מפגש במדיום הנשרים המהונדס של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-100 יחידות פניצילין, 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין ו-0.292 מיליגרם למיליליטרים L-גלוטמין. לאחר מכן, דגירו את התרבית הזו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות ב-5% פחמן דו-חמצני.
מעבירים את התאים על ידי שאיפת המדיה מצלחת התרבית באמצעות פיפטה סרולוגית ושוטפים אותם פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS 1X מעוקר. לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת חומצה טריפסין אתילנדיאמינט-אצטית ולאחר חמש דקות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, החייאת תאים אלה בשני מיליליטרים של מדיית גדילה באמצעות פיפטה סרולוגית. מעבירים את מתלי התא לצינור וצנטריפוגה טריים ונקיים של 15 מיליליטר ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הסר בעדינות את ה-supernatant ובצע החייאה של גלולת התא בשלושה מיליליטרים של מדיית גדילה על-ידי צפירה למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיף תא הומוגני. לאחר מכן, העבר מיליליטר אחד של תרחיף תא זה לתבשיל תרבית TC שטופל ב-100 מילימטרים המכיל תשעה מיליליטרים של מדיית גדילה. לפני הטרנספקציה, יש לאשר אם התאים נקיים מזיהום ובמפגש הולם עבור טרנספקציות חולפות.
עבור כל דגימת טרנספקציה, הכינו את קומפלקסי הדנ"א-פוליאתילן-פוליאתילן על ידי דילול שלושה מיקרוגרם של כל פלסמיד ב-100 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת Opti-MEM 1 ללא תוספת וערבובו בעדינות על ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה. לאחר מכן, להפשיר את הדנ"א-פוליאתילן בטמפרטורת החדר ולהוסיף אותו לתמיסה בעקבות פרופורציה של שלושה מיקרוליטרים של DNA-פוליאתילן לכל מיקרוגרם אחד של דנ"א. הומוגניזציה של התמיסה על ידי צנרת למעלה ולמטה.
לאחר מכן, דגירה אותו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים DNA-פוליאתילן. הוסיפו את הנפח הכולל של קומפלקסי דנ"א-פוליאתילן-פוליאתילן לכל מנה המכילה את תרבית התאים וערבבו אותה בעדינות על ידי נדנדת הצלחת קדימה ואחורה. לאחר מכן, דגירו את התאים האלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות.
לאחר הדגירה ושש שעות לפני הדגירה, טפלו בתאים שעברו טרנספקציה באמצעות מעכב פרוטאזום MG132 בעל 10 מיקרומולר ודגמו את התאים בחממת תרביות התאים הלחות. לאחר מכן, שאפו את המדיה מכל צלחת תרבית באמצעות פיפטה סרולוגית ושטפו את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של 1X PBS. לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי הוספת טריפסין מיליליטר אחד ודגרו את המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
בצעו שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיית גדילה והעבירו את תרחיף התא למיקרו-צינורית דו-מיליטרית טרייה ונקייה וצנטריפוגה ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסירו את הסופרנטנט על ידי מזיגתו בזהירות והחזירו בעדינות את גלולת התא ב-200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה MP40 קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכבי הפרוטאז והפוספטאז. לאחר מכן להעביר את הפתרון הזה למיקרו-טיוב נקי של 1.5 מיליליטר.
דגירה של תא זה ליזאט במשך 30 דקות על קרח, ולאחר הדגירה, צנטריפוגה התא lysates ב 16, 900 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בינתיים, לאזן את החרוזים נגד HA אגרוז עם חיץ ליזה MP40 קר כקרח. השתמש ב-15 מיקרוליטרים של חרוזי אגרוז אנטי-HA עבור כל דגימה.
לשטוף את החרוזים עם 200 microliters של מאגר ליזה MP40 על ידי פעימתם בצינור מיקרו צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנטנט בזהירות עם פיפטה וחזרו על התהליך הזה שלוש פעמים. לאחר מכן, השאירו את החרוזים מאוזנים על קרח עד לשימוש.
לאחר צנטריפוגה של התא ליזאט, לשחזר את הסופרנטנט ולכמת את תכולת החלבון בליזאט הכולל באמצעות שיטת ברדפורד כדי להבטיח שכל דגימה הנתונה לפרציפציה חיסונית מציגה כמות שווה של חלבון. דגירה את הנפח הדרוש של ליזאט התא עם חרוזי האגרוז האנטי-HA המשוזנים במשך ארבע שעות, תוך סיבוב עדין באינקובטור מסתובב בארבע מעלות צלזיוס, מה שמאפשר ל- UXT-V2-HA להיקשר לחרוזים האנטי-HA האגרוזים. אספו את החרוזים נגד HA על ידי פעימות שלהם בצינור מיקרוצנטריפוגה ב-3, 000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ ליזיס של תאי MP40 קרים כקרח ופעמיים עם חיץ FLAG HA קר כקרח. לאחר הכביסה הסופית, הסר את כל הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה והורד את החלבון הפולי-יוביקוויטילציה עם 300 מיקרוגרם למיליליטר של פפטיד HA המדולל על חיץ FLAG HA.
דגירה של חרוזי אנטי-HA אגרוזים עם פפטיד HA למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס בפלטפורמת שייקר מתנדנדת. לאחר מכן, סובבו את החרוזים ב-3, 000 פעמים G במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס והסירו בזהירות את הסופרנטנט המכיל את החלבונים הרב-יוביקוויטינאטים. במידת הצורך, יש לאחסן את האלוף במיקרו-טיוב טרי ונקי במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לפתור את eluents ואת התא lysates ב 10% נתרן דודציל סולפט polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה ו immunoblotting. כדי לבצע כתם מערבי להעברה רטובה, מניחים את הג'ל בכריך העברה המורכב מנייר סינון, נייר סינון קרום ג'ל, מרפדים אותו ברפידות ולוחצים עליו יחד על ידי רשת תמיכה. לאחר מכן, מקם מערכת זו אנכית במיכל מלא בחיץ העברה בין אלקטרודות תיל נירוסטה או פלטינה.
ההעברה מתרחשת במשך 90 דקות ב 150 וולט במאגר העברה רטוב. לבסוף, בדקו את קרום האימונובלוט באמצעות נוגדן אנטי-מייק. הפולי-יוביקוויטילציה הספציפית של UXT-V2-HA המתווכת על ידי חלבון F-box 7 בתאים נצפתה לאחר שבדקה את ה-eluent מ-anti-HA immunoprecipitation עם נוגדן נגד myc, המזהה את ה-myc-ub המצומד למצע.
הספציפיות של אנטי-מיק עבור מצע פולי-יוביקוויטילציה הוצגה בנתיבים 1 ו-2, שבהם לא זוהתה מריחה של חלבונים פולי-יוביקוויטילציה כאשר התאים עברו טרנספקטציה משותפת עם חלבון F-box 7 ו-myc-ub בהיעדר פלסמיד UXT-V2-HA. בנוסף, לא הודגם שום מריחה המתאימה לפולי-יוביקוויטינציה של חלבון בשילוב של חלבון F-box 7 ו-UXT-V2-HA ללא ה-myc-ub plasmid. כאשר חלבון F-box מסוג F בעל וקטור ריק מסוג F-box 7 או F-box חלבון 7 מוטציה שלא היה מסוגל להרכיב SCF פעיל הומר בשילוב עם UXT-V2-HA ו- myc-ub, נצפה אות מריחה חזק של UXT-V2 רב-יוביקוויטילציה רק עבור חלבון F-box מסוג פראי 7, מה שמרמז על כך ש-UXT-V2 היה רב-יוביקוויטילציה על ידי קומפלקס קומפלקס SCF F-box 7 ותאים בהשוואה לבקרים.
הצעדים החד-משקעיים, כולל דגירה של ליזטים של תאים עם החרוזים המשוזנים וההתרוממות של חלבונים שעברו חיסון, חיוניים להשגת המטרה של פרוטוקול זה. לאחר הליך זה, יש לבצע בדיקת יוביקוויטילציה במבחנה כדי לאשר את הספציפיות של יוביקוויטילציה של המצע על ידי הליגאז E3.
