Questo protocollo passo-passo mostra come rilevare e caratterizzare funzionalmente l'attività enzimatica delle ligasi ubiquitina ring-type E3, sia in vitro che in planta, attraverso un approccio di mutagenesi site-directed. Introducendo la mutazione in un dominio RING attraverso la mutagenesi site-directed, il mutante risultante carente di E3 può essere testato in parallelo con la proteina di tipo selvatico per collegare l'attività enzimatica con la funzionalità. Chiarire le basi biochimiche e meccaniche delle ligasi ubiquitina E3 di tipo RING può contribuire notevolmente alla nostra comprensione del loro significato biologico nello sviluppo, nella segnalazione dello stress e nel mantenimento dell'omeostasi.
Con una leggera modifica del sistema di espressione in vivo, questo protocollo può essere applicato all'analisi di qualsiasi ligasi RING-type E3 indipendentemente dalla sua origine. Inizia identificando i Cys conservati e i suoi amminoacidi nel dominio RING e progettando primer che portano il codone di sostituzione di interesse affiancato da 15 coppie di basi su entrambi i lati del sito di mutazione. È fondamentale identificare correttamente il dominio RING, in particolare la cisteina conservata e i residui di istidina.
Strumenti online come PROSITE possono essere utilizzati per farlo. Utilizzare i primer mutageni nell'amplificazione PCR per introdurre la mutazione desiderata nel plasmide che ospita il gene di interesse, assicurandosi di utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà, come Pfu. Dopo la PCR, digerire il DNA metilato e semimetilato derivato dall'E.coli aggiungendo tre microlitri di enzima di restrizione Dpnl direttamente alla reazione PCR e incubandolo a 37 gradi Celsius per due ore.
Purificare i plasmidi mutagenizzati con un kit di estrazione del DNA commerciale ed elutare il DNA in 50 microlitri di acqua. Quindi, trasformare le cellule chimicamente competenti DH5-alpha E.coli con 0,5 microlitri del DNA plasmide mutagenizzato recuperato secondo il protocollo del produttore. Clonare i geni RING di tipo selvaggio e RING mutati di interesse nel vettore pMAL-c2 per fondere questi geni con il tag epitopo MBP.
Quindi, impostare la reazione di ubiquitinazione in vitro in un volume totale di 30 microlitri, come descritto nel manoscritto, e incubare la miscela a 30 gradi Celsius per due ore. Terminare la reazione mescolando il campione con 7,5 microlitri di tampone di carico 5x SDS-PAGE e facendolo bollire per cinque minuti, quindi separare le proteine con elettroforesi del gel di poliacrilammide 7,5%.5%.. Trasferire sulla membrana PVDF e rilevare l'ubiquitinazione con gonfiore occidentale e anti-FLAG.
Macchiare la membrana con Coomassie blue per verificare lo stesso carico della proteina mbp-ring testata. Striare i ceppi di Agrobacterium tumefaciens che trasportano il gene di interesse etichettato epitopo su supporto LB contenente gli antibiotici di selezione appropriati. Dopo due giorni di crescita a 28 gradi Celsius, raccogli singole colonie e coltivale in mezzo liquido LB con antibiotici a 28 gradi Celsius e 250 giri/min per altre 24 ore.
Trasferire 100 microlitri di coltura agrobatterica a tre millilitri di LB fresco con antibiotici e incubare la coltura per altre quattro o sei ore. Spingi le cellule a 1.800 volte g per sei minuti, scarta il supernatante e rimescola le cellule con tre millilitri di tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio due volte, quindi rimospendare le cellule nel tampone di induzione e incubarle per altre 10-12 ore a 28 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 1.800 volte g per sei minuti e scartare il supernatante. Resostipendare le cellule con due millilitri di tampone di infiltrazione e determinare la concentrazione di batteri utilizzando il valore OD600. L'agroinfiltrato Nicotiana benthamiana di quattro settimane lascia pungendole delicatamente con un ago e iniettando a mano Agrobacterium con una siringa, quindi cerchia l'area infiltrata con un marcatore.
Dopo 36 ore, raccogliere il tessuto fogliare infiltrato e macinarlo in una polvere fine con azoto liquido. Rimostrare la polvere di tessuto con 300 microlitri di tampone di estrazione proteica e centrifugarla a 15.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante su un tubo fresco, aggiungere il tampone di carico 5x SDS-PAGE a una concentrazione finale di 1x e far bollire il campione per cinque minuti.
Quindi, eseguire l'analisi western blot per rilevare nell'ubiquitinazione planta. Striare i ceppi di Agrobacterium tumefaciens appropriati che trasportano geni taggati di interesse o vettore vuoto, e iniettare l'Agrobacterium sulle foglie di Nicotiana benthamiana, come descritto in precedenza. Per la degradazione della proteina del substrato dipendente dall'E3, seguire il protocollo descritto in precedenza ed eseguire l'assorbimento occidentale con anticorpi appropriati per rilevare l'accumulo di proteine nelle cellule vegetali.
Per l'inibizione della morte cellulare mediata dalla risposta ipersensibile dipendente da E3, monitorare le foglie agroinfiltrate per i sintomi della morte cellulare da due a quattro giorni dopo l'infiltrazione. Un tipico risultato del saggio di ubiquitinazione in vitro contiene uno striscio multibanda che inizia dal peso molecolare della proteina testata e progredisce verso l'alto. Come previsto, i controlli negativi che mancano di singoli componenti o utilizzano MBP non hanno dimostrato il segnale spalmato.
Inoltre, la colorazione blu Coomassie della membrana PVDF ha mostrato lo stesso carico di MBP-RHA1B o MBP in tutti i controlli. Sono stati testati 11 diversi E2 per studiare come l'ubiquitinazione in vitro varia a seconda della combinazione specifica da E2 a E3. L'attività di ubiquitinazione rilevata variava da nessun segnale a uno striscio multibanda a partire da diversi pesi molecolari, indicando diversi modelli di ubiquitinazione.
Le versioni RING e K-mutant di RHA1B sono state testate per l'ubiquitinazione in vitro e in planta. La mancanza di attività enzimatica della versione ring-mutante è supportata dalla sua incapacità di generare uno striscio multibanda in vitro o promuovere il segnale di poli-ubiquitinazione nei planta. Sebbene sia stato rilevato un segnale di auto-ubiquitinazione marginale in vitro per il mutante K, è stata rilevata solo l'ubiquitinazione di fondo nelle planta, suggerendo che il residuo K146 è essenziale anche per l'attività E3.
A differenza del tipo selvaggio RHA1B, il mutante RING privo di attività ligasi E3 non interferiva con la morte delle cellule di risposta ipersensibili. Western blotting ha confermato che il Gpa2 non si è accumulato in presenza di RHA1B di tipo selvatico, ma il mutante RING non ha avuto alcun impatto sulla stabilità proteica. Dato che una corretta combinazione E2-E3 è necessaria per la reazione di ubiquitinazione, i test di ubiquitinazione in vitro devono essere trasportati in parallelo con più enzimi E2 che rappresentano diverse classi E2 per evitare risultati falsi negativi.
Un mutante carente di ligasi E3 facilita il test delle interazioni enzima-substrato in vivo. Inoltre, questo mutante spesso conferisce un fenotipo negativo dominante che può essere utilizzato negli studi funzionali ad eliminazione diretta come approccio alternativo alla RNAi. Utilizzando questo protocollo, è stato recentemente scoperto che l'effettore nematode RHA1B interferisce con la segnalazione immunitaria delle piante in modo dipendente dall'E3 prendendo di mira l'immunorecettore Gpa2 della pianta per l'ubiquitinazione e la degradazione.
