פרוטוקול זה משמעותי משום שהשימוש ברקמה קפואה מפשט את הלוגיסטיקה בעת הערכת רקמות מרובות, מאפשר העברת דגימות למעבדה מרוחקת לצורך ניתוח ומאפשר דחיית החלטה לנתח רקמה במשך חודשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשימוש ברקמת קובייה קפואה אינו דורש כוח אדם מאומן בבדיקת שביט בנמק, וממזער את ההזדמנות לטעויות טכניות ונזקי DNA מכניים שהוכנסו במהלך מניפולציה מדגם. טכניקה זו יש יישום בפיתוח תרופות פרה קליניות, הערכת הבטיחות של כימיקלים הנכנסים לסביבה, ותוספי מזון.
ניתן להשתמש ברקמות קפואות בבדיקת שביט כדי להעריך פוטנציאל גנוטוקסי, תיקון דנ"א, השפעות מגן מפני נזקי דנ"א הנגרמים על ידי כימותרפיה או הקרנות, ולניטור ביולוגי סביבתי. באופן אידיאלי, ניסויים צריכים להיות מתוכננים כדי לאפשר עיבוד של כל דגימת רקמה לשלב ההקפאה לפני איברים שנקטפו מן החיה הבאה להיות זמין לעיבוד. ניתן לתבוע רקמות קפואות בבדיקת שביט כדי להעריך את הפוטנציאל הגנוטוקסי, תיקון DNA, השפעות מגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי כימותרפיה או הקרנות, ועל ניטור ביולוגי סביבתי.
המאמנת הטכנית קרול בוביט, ומנהלת המעבדה לטוקסיקולוגיה החוקרת איילין גילאס, תכהן היום בתור פרוקטורים. עמיתת המחקר לינקולן מרטין, וטכנאית ההיסטרולוגיה אמלי לאדסור יפגינו טיפול לדוגמה. כדי להתחיל בהליך זה, הסר את כל הרקמות, האיברים והפסולת המחוברים מאיבר מעניין.
מיד להניף את האיבר במרץ בסירת שקילה בגודל בינוני המכילה כשבעה מיליליטר של פתרון טחון קר, מוכן טרי כדי להסיר שאריות דם ופסולת. מעבירים את האיבר לסירת שקילה נקייה אחרת המכילה פתרון טחון קר מספיק כדי לשמור על הרקמה שקועה ולשמור אותה על הקרח עד לעיבוד נוסף. עבור הכבד, לחתוך קטע אורך חמישה מילימטר של האונה השמאלית בעדינות swish בערך שבעה מיליליטר של פתרון טחון קר.
לאחר מכן מניחים את רצועת הרקמה לתוך סירת משקל בינונית נקייה המכילה כשבעה מיליליטר של פתרון טחון קר ולשמור על קרח עד מוכן לעבד עוד יותר. מוציאים חלק מהכבד ומ מניחים אותו בקלטת הטבעה. בצע תיקון, גיזום והטבעת פרפין בהתאם לנהלים הסטנדרטיים במעבדה להערכת היסטופתולוגיה עתידית אפשרית.
עבור התריסום, לחתוך חלק 10 מילימטר של התריסום proximal לקיבה. הכנס מחט מד 21 כדי 25 בקצה אחד של התריסום לשטוף אותו עם מיליליטר אחד של פתרון טחון קר כדי להסיר את כל פסולת וחיידקים. להפוך את התריסום מעל, לשטוף אותו שוב עם עוד מיליליטר אחד של פתרון טחון להשליך את המחט.
פורסים את התריסום ושטיפתו בשבעה מיליליטר של פתרון טחון. לאחר מכן לשטוף את התריסום שוב ולשמור אותו פתרון טחון על קרח עד מוכן לעבד עוד יותר. חותכים ומתקן חלק מהתריסריון הנותר להערכת היסטופתולוגיה עתידית אפשרית כפי שתואר קודם לכן עבור הכבד.
עבור המוח, זה עשוי להיות שימושי תחילה לחלק את המוח לשתי המיספרות, עם חצי כדור אחד נשמר עבור היסטופתולוגיה אפשרית. לנתח את אזורי המוח של עניין, ולאחר מכן בעדינות לשטוף אותם, ולשמור על קרח בת פתרון טחון עד מוכן לעבד עוד יותר, כפי שתואר קודם לכן עבור הכבד ואת התריסום. עבור הקיבה, להסיר ולהשליך את forestomach.
חותכים את הבטן הבלוטות, ולשטוף אותו ללא מזון על ידי swishing אותו בסירת שקילה בגודל בינוני המכיל כ 7 מיליליטר של חיץ טחון קר. הסר רצועה של חמישה מילימטר של קיבה הבלוטות proximal לתריסריון לקיבעון להערכת היסטופתולוגיה אפשרית כמתואר קודם לכן. מניחים את הבטן הנותרת לתוך סירת שקילה בגודל בינוני המכילה כשבעה מיליליטר של חיץ טחון קר דגירה על קרח במשך 15 עד 30 דקות.
לאחר מכן, להעביר את הבטן לחתיכה נקייה של פרפין ולהשתמש להב אזמל או מגרד תא פלסטיק בעדינות לגרד את האפיתל פני השטח לפחות פעמיים כדי להסיר פסולת. להרים את רירית הקיבה עם מלקחים ולהשתמש פיפטה לשטוף אותו עם מיליליטר אחד של חיץ טחון קר. מעבירים את רקמת הקיבה שטוף למשטח נקי או צלחת ומוסיפים פתרון טחון קר.
השתמש בחלק האחורי של להב אזמל או מגרד תא פלסטיק כדי לגרד בזהירות את אפיתל הקיבה ארבע עד חמש פעמים כדי לשחרר את התאים. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי לאסוף את פתרון טחון המכיל את התאים ששוחררו, ולהעביר אותו צינור microcentrifuge על קרח. לדגימות רקמה טחון, לחתוך קטע של כבד, מוח, או התריסום ולהעביר אותו צינור microcentrifuge שכותרתו המכיל מיליליטר אחד של פתרון טחון קר.
השתמש מספריים טחון כדי לטחון במהירות את המדגם עד שהוא סוף סוף התפזר, תוך הבטחת כי המדגם נשאר קר. המדגם אמור להיראות מעונן מעט. עם זאת, זה נפוץ עבור חלקים מסוימים להישאר כי יתיישב לתחתית הצינור.
כדי להשתמש ברקמה בזמן שהיא טרייה, לשמור על הצינורות המכילים את הדגימות על הקרח. כדי להקפיא את דגימות הרקמה, לאבטח את המכסה של הצינור מיד לאחר טחון או איסוף ולשחרר את הצינור לתוך בקבוק Dewar המכיל חנקן נוזלי. בסיום קציר הרקמות, השתמשו במחבת כדי לאחזר את צינורות הדגימה, וה מניחים אותם על קרח יבש למיון.
מעבירים את הצינורות לקופסת מקפיא על קרח יבש ומאחסנים את הקופסה במקפיא במינוס 80 מעלות. כדי להכין קוביות קפואות של רקמה, לחתוך כמה חתיכות קטנות של רקמה בנפרד להפיל אותם ישירות לתוך סירת שקילה בגודל בינוני או כלי מתאים אחר המכיל חנקן נוזלי במשך כמה שניות. לאחר שהחתיכות קפאו לחלוטין, מעבירים את קוביות הרקמה הקפואה בנפרד לצינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים, או לצינורות קריו, על קרח יבש.
בסיום קציר הרקמות, מעבירים את הצינורות לקופסת מקפיא על קרח יבש ומאחסנים את הקופסה במקפיא במינוס 800 מעלות צלזיוס. בעת שימוש ברקמה טרייה טחון או שרוט מתוחזק על קרח רטוב, להכין מגלשות שביט בתוך שעה של הקציר. בעת שימוש ברקמה טחון או מגרד קפוא, מניחים צינורות של רקמה קפואה באמבט מים בטמפרטורת החדר עד שהדגימות מופשרות לחלוטין תוך הבטחה שהן נשמרות קרות.
ברגע שהדגימות מופשרות, מיד מעבירים את הצינורות לקרח. עבור רקמת קוביות, לאחזר את הצינורות המכילים את הקוביות מהמקפיא ולשמור על קרח יבש עד הכנת החלקה. Aliquot מיליליטר אחד של מדיום הסוחר או פתרון טחון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שכותרתו 1.7 מיליליטר עבור כל מדגם ולשמור על קרח.
עובדים במהירות כדי למנוע הפשרה, מניחים קוביית רקמה בקצה הפתוח של מכשיר טחון רקמת טמפרטורת החדר. הכנס במהירות בוכנה מזרק תואם גודל לתוך המכשיר כדי לדחוף את הרקמה לתוך קצה רשת, אשר לאחר מכן צריך להיות ממוקם לתוך צינור microcentrifuge המכיל את פתרון טחון קר. לטבול את הקצה רשת של המכשיר במשך כ 5 עד 10 שניות בתווית טחון קר כדי לאפשר את הרקמה להפשיר לחלוטין.
מדכא לחלוטין את הבוכנה עד שתאים נראים בולטים דרך נקבוביות רשת. ואז למשוך את הבוכנה עד כ 2.5 ס"מ ולחץ למטה שוב לחלוטין. חזור מספר פעמים, עד פתרון הטחון הופך לעכור.
כדי להכין שקופיות, מערבבים מתלה תא בעדינות, ומעבירים 50 מיקרוליטרים לצינור המכיל 450 מיקרוליטרים של 0.5% נקודת התכה נמוכה התעוררה ב 37 מעלות צלזיוס. הכן והבקיע את השקופיות כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר הראשון, הכבד נקצר משתי קבוצות של חולדות בקרת רכב זכר ספראג דאולי התנדנד על ידי שבוע אחד.
שקופיות הוכנו מרקמות טחון טרי, רקמה טחון קפוא, ורקמות קוביות קפואות. מאז ה-OECD המליץ על הגבול העליון עבור אחוז DNA הזנב בכבד חולדה טרי הוא 6%התוצאות האלה מראות כי כל אחת משיטות ההקפאה יכול לעבוד היטב להערכת רקמות. בסך הכל, אחוז הקיפודים מקביל לדנ"א של אחוז הזנב, אם כי רקמות קפואות הציגו שונות רבה יותר.
במחקר השני, עכברי B6C3F1 נקבה נוהלו רכב או אתיל מתנסולפונט mutagen. תוצאות הדנ"א של הזנב מצביעות על כך שרקמת הכבד קפאה כקוביות ולאחר מכן מעובדת באמצעות מכשיר טחון הרקמות הניבה תוצאות דומות מאוד לאלה שהושגו עבור רקמה טחון טרי. עלייה מובהקת סטטיסטית בנזק לדנ"א המושרה על ידי EMS נמדדה בדגימות רקמה המעובדות על ידי כל שלוש השיטות.
במחקר השלישי, דגימות כבד שנאספו עכברים B6C3F1 נקבה במחקר רעילות כימית 90 יום נותחו. נזקי הדנ"א ברקמה הטחון הקפואה היו גבוהים בכל קבוצות המינון, עם שונות משמעותית בין בעלי חיים לבעלי חיים. תוצאות הדנ"א של הזנב התאימות לאחוז הקיפודים, מה שמצביע על כך שהקיפודים תרמו באופן משמעותי לרמה הגבוהה של נזק לדנ"א שנצפה בדגימות אלה.
לעומת זאת, הן DNA פגום ואחוז קיפודים היו נמוכים מאוד ברקמת קוביות קפוא פלאש שהוכן במקביל לדגימות רקמה טחונות. לכן, התאים הפגועים מאוד שהתבטאו בקיפודים בדגימות הרקמה הטחונות לא היו בבירור תוצאה של תהליך ביולוגי, אך ככל הנראה הוכנסו על ידי הפרעה מכנית, ו, או התחממות רקמות במהלך הליך הטחון לפני הבזק קפוא. לכן, הנתונים עבור רקמה טחון נחשבו לא אמינים.
לשם השוואה, נתונים באיכות גבוהה התקבלו מרקמה קוביית קפואה, גם לאחר אחסון ממושך. זה קריטי כדי לשמור על רקמות שנקטפו קר לח, ולעבוד במהירות כדי להקפיא את הדגימות. כמו כן, רקמת קוביה קפואה צריכה להיות מופשרת מיד לפני שלב הומוגניזציה.
דגימות רקמה קפואה מתאימות ליישומים אחרים במורד הזרם, כולל למשל, שינויים בהערכת שביט כדי לזהות נזק חמצוני או הצלבה, והערכת שינויים בביטוי גנים. יש לנקוט זהירות בעת טיפול בלהבי אזמל כדי לחתוך או לגרד רקמות, וכאשר מטפלים בחנקן נוזלי במהלך תהליך ההקפאה.
