Name: comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

ברצוננו להודות לStiftung LHW, בTriesen ליכטנשטיין, לתמיכה במחקר כלכלי שלנו על סטרס חמצונים.

מחקרים על assay שביט שבוצעו באוניברסיטת באזל, מחלקת העיניים אושרו על ידי ועדת אתיקה המקומית באזל 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בופר פוספט של Dulbecco (PBS) (Ca ++, Mg ++ חינם) פתרון על ידי הוספה (L 1 שקית) PBS ו990 מיליליטר של DH 2 O לתקשורת. התאם את ה- pH 7.4. אחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון lysing: כדי להכין 1,000 מיליליטר להוסיף 2.5 M NaCl (146.1 גר &#39;), 100 מ&quot;מ EDTA (37.2 גר&#39;) ו -10 מ&quot;מ בסיס Trizma (1.2 גרם) ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ אלקטרופורזה (300 מ&quot;מ NaOH / 1 mM EDTA) על ידי הוספת 30 מיליליטר של 10 M NaOH ו 7.5 מיליליטר של 0.2M EDTA, QS למיליליטר 1500 DH 2 O ומערבבים היטב. הנפח הכולל תלוי ביכולת תיבת ג&#39;ל. לפני השימוש, למדוד את ה- pH של המאגר כדי להבטיח pH של&gt; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ נטרול המכיל 0.4 M טריס (48.5 גר &#39;הוסיף ל~ מיליליטר 800 DH 2 O, להתאים את ה- pH 7.5), מרוכז (&amp; #62; 10 M HCl) ב1,000 מיליליטר עם DH 2 א &#39; אחסן את הפתרון בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מכתים. לethidium ברומיד (EtBr; מניית 10x, 20 מיקרוגרם / מיליליטר) להוסיף 10 מ&quot;ג של EtBr ב 50 מיליליטר DH 2 O וחנות ב RT. למאגר 1x - לערבב 1 מיליליטר עם 9 מיליליטר DH 2 א &#39; זהיר! ידית EtBr עם אמצעי זהירות נאות כפי שהוא חומר מסרטן ידוע. </li></ol> 2. בידוד של לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות דם אנושיות (20 מיליליטר) עם נוגדת קרישה כגון הפרין באמצעות ניקור ורידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את ימפוציטים באמצעות מפריד תא שיפוע צפיפות כגון Histopaque. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לדלל דם ב 1: 1 יחס עם PBS או RPMI (ללא FBS) ושכבה מעל 600 נוזלי מפריד תא μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 1800 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב את המעיל &#39;באפי&#39; ל3-5 מיליליטר של PBS / RPMI וcentrifuged XG ב 300 במשך 10 דקות עד גלולה לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר לימפוציטים מבדיוק מעל הגבול בין PBS (RPMI) ונוזל מפריד תא, באמצעות pipettor. הסר את להקות יקוציט מהממשק בין הפלזמה ושכבות נוזל מפריד תא של כל צינור ולאסוף לתוך שפופרת 50 מיליליטר אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח הכולל 50 מיליליטר עם הנשר בינוני של Dulbecco הקר השתנה (DMEM). שטוף את ההשעיה תא שלוש פעמים עם DMEM XG ב 300 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות haemocytometer. להשעות את תאי PBS וaliquote לתוך צינורות microcentrifuge ב 10 7 תאים / צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 0.4 מיליליטר של תאים לתוך צינור פלסטיק חד פעמי 5 מיליליטר. להוסיף 1.2 מיליליטר 1% agarose-gelling בטמפרטורה נמוכה ב 40 מעלות צלזיוס. מערבבים במהירות וpipet 1.2 מיליליטר של השעיה תא על פני השטח מכוסה agarose של שקופית מצופה מראש. הימנע לייצר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose לג&#39;ל לכ -2 דקות. להיות עקבי עם הזמן וטמפרטורה המשמש לgelling, ולהבטיח כי agarose מוגדר באופן מלא לפני הצללה בפתרון תמוגה. לאחר מלא שלאח, לצלול לתוך lysing פתרון ב ~ 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. תמוגה ואלקטרופורזה הערה: ההליך המתואר היא אלקטרופורזה בתנאי pH&gt; 13 אלקליין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי לפחות שעת 2 ​​ב ~ 4 המעלות צלזיוס, בעדינות להסיר שקופיות מפתרון lysing. מקום מחליק לצד זה על תיבת ג&#39;ל האופקי ליד קצה אחד, מחליק אותם כקרוב זה לזה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מאגרי חיץ עם חיץ pH&gt; 13 אלקטרופורזה טריה עד רמת הנוזל מכסה את השקופיות (למנוע בועות על agarose) לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות לשבת במאגר בסיסי במשך 20 דקות כדי לאפשר להתרה של ה- DNA והביטוי של נזק אלקלי-יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל אספקת חשמל ל -25 וולט (~ 0.75 V / סנטימטר) ולהתאים את נוכחי 300 milliamperes על ידי העלאה או הורדת רמת החיץ. Electrophorese השקופיות למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הכח. רם בעדינות את השקופיות מהחיץ ועמ &#39;תחרה על מגש ניקוז. זרוק מעיל חכם השקופיות עם נטרול מאגר. אפשר השקופיות לשבת במשך לפחות 5 דקות. מסננים שקופיות ולחזור עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השקופיות עם 80 μl 1x ethidium ברומיד (EtBr) ולהשאיר למשך 5 דקות ולאחר מכן לטבול במים מזוקקים מצוננים כדי להסיר כתם עודף. אז במקום coverslip על השקופית ולאחסן אותם באופן מיידי. חנות מחליקה לחודש ב RT בתנאים יבשים. הערה: כתמי DNA אחרים (למשל, SYBR-ירוק) עשויה לשמש גם. זהירות! ללבוש כפפות מגן כמו רוב הצבעים הם mutagenic. </li></ol> 4. כימות Breaks DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הנזק לדנ&quot;א, להתבונן שקופית DNA המוכתמת-EtBr תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי האובייקטיבי 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך כמותית נזק לדנ&quot;א בתאים על ידי מדידת האורך של הגירת DNA ואחוז DNA היגר (איור 1 א). לכמת נזק לדנ&quot;א (איור 1) מהרגע לרגע וזנב הזית-momeNT. הגדרות של זנב-רגע והזית -Moment בעבר ניתנו 8-10. הערה: מניסיוננו זה מספיק כדי להישאר באחד מהפרמטרים. התאים מצולמים על ידי הגדרת הכלי האוטומטי שסורק על תאי שקופיות מיקרוסקופ ותצלומים. כימות של הפסקות DNA יכולה להיעשות על ידי חבילות תוכנת ניתוח תמונה. ישנן מספר חבילות תוכנה שונות כי הם עשו מותאמים אישית כדי ללכוד את התמונה של התאים ולכמת נזק לדנ&quot;א. אנו ממליצים על שימוש באותה חבילת תוכנה לאורך כל הניסוי. טכנאי המעבדה מזהה את התא או השביט שלם שקלע במחשב ולוחץ עם העכבר על זה. תא השביט או שלם לאחר מכן הבקיע באופן אוטומטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

אין.

מדענים שוודי אוסטלינג וג&#39;והנסון היו הראשון בתחומם להשתמש assay השביט לכמת נזק לדנ&quot;א בתאי 1. התנאים ניטראליים ששני המדענים השתמשו, לעומת זאת, רק אפשרו זיהוי של הפסקות פעמיים גדילי דנ&quot;א. סינג et al. מאוחר יותר מותאם assay לשימוש תחת תנאים בסיסיים, אשר הפיק גרסה רגישה שיכול להעריך הפסקות כפולות וחד-גדילי דנ&quot;א ולזהות אתרי אלקלי-יציב 12. מאז הפיתוח הראשוני שלה, assay השתנה בצעדים שונים על מנת להפוך אותו מתאים להערכת סוגים של נזק לדנ&quot;א בתאים מסוגים שונים 13-15. כמו בכל הטכניקות, תשומת לב קפדנית לפרטים טכניים חשוב להשיג תוצאות מדויקות 16. בהתבסס על הניסיון שלנו, התוצאות הטובות ביותר מתקבלות אם כל צעד-ממתודולוגיים הכנת פתרון לשביט כימות-מבוצע על ידי המעבדה techn מומחהicians. השימוש בתקשורת טרי ומוכנה בצורה נכונה, טכניקות pipetting נאותות, תזמון מדויק ו( כאמור בסעיף התוצאות) השימוש של לויקוציטים מוכן הטרי הם חיוני על מנת שתמוגה וג&#39;ל אלקטרופורזה כדי להשיג תוצאות מדויקות 17. כל הצעדים הבודדים בassay זה חשובים באותה מידה לקבלת תוצאות אמינות. 16 באופן כללי התוצאות הטובות ביותר מתקבלים אם כל צעד מתודולוגית מהכנת פתרון עד כימות שביט מבוצע על ידי המעבדה technicians.Important מומחה נראים את השימוש בתקשורת טרי ומוכנה בצורה נכונה , טכניקות נאותות pipetting, תזמון מדויק וכפי שכבר התייחסו בסעיף תוצאות השימוש של לויקוציטים מוכן הטרי לתמוגה וג&#39;ל אלקטרופורזה-כדי להשיג תוצאות מספקות מassay 17. כלעשות מתודולוגיות אחרות, יש טכניקת assay שביט advanTages וחסרונות. להיות שיטה רגישה, assay הוא פגיע לגורמים (לדוגמא, אור UV) אשר יכולה להגדיל את הפסקות DNA ובכך להשפיע על תוצאות. כל גורם שעשוי לשפר את לחץ חמצוני, חוץ מזה שבו נחקר, יש להימנע. גורמי לחץ יכול להעלות את הרמה של סטרס חמצונים לא רק בכדוריות דם לבנות, אלא גם בכל המדיומים הדם האחרים ולימפוציטים. כפי שהוזכר קודם לכן יש דרכים שונות וישירים יותר רבות של מדידת לחץ חמצוני 18,19. Assay השביט הוא אחת משיטות רבות שבו יש יתרונות מסוימים. אלה כוללים את העלות שלה נמוכה יחסית, במספר הקטן של תאים הנדרשים (&lt;10,000 תאים) ובכך הדגימות הקטנות של דם הנדרשת לחולה, בתקופה היחסית הקצרה של זמן הנדרש כדי לכמת נזק לדנ&quot;א בתאים (כ 3 ימים), הרגישות שלה והתחולה רחבת התפשטותו לנזק לדנ&quot;א ישבנים בתא-סוגים שונים. בעבר אנו בוחרים לעבוד עם כדוריות דם לבנות מאז שהיו לנו ניסיון עם זהתאים מסוג וזה היה רלוונטי למחקר המסוים המתוכנן. יתרון נוסף של assay השביט הוא שזה יכול לשמש כדי לזהות סוגים ורמות של נזק ל- DNA שונים ולכן יכול להיות מיושם בתחומים שונים של לימודים מלבד סטרס חמצונים כגון מחקרי תיקון DNA, ניסויי תוספים או לימודי genotoxicity. סטרס חמצונים מוכר כיום כמשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של מחלות רבות. שיטת assay השביט, בעוד אחת מדרכים רבות למדידת לחץ חמצוני 18,19, היא יחסית פשוטה, תכליתית וזולה. כאשר שולטים, בשיטה זו ניתן להשתמש בכל תחומי הרפואה שבסטרס החמצונים משחק התפקיד 8-10,20,21.

assay שביט היה ראשון שפותח על ידי מדענים שוודי אוסטלינג ו1 ג&#39;והנסון. ה- DNA הוא מולקולה טעונה שלילי. במהלך אלקטרופורזה, שברים קטנים, שנפגעו DNA לנסוע מהר יותר לכיוון האנודה טעונה חיובי 2. שברי DNA קטנים יותר, ההגירה שלהם מהר יותר לכיוון האנודה ליצירת &quot;כוכב שביט&quot; טיפוסי עם &quot;ראש&quot; המורכב מ- DNA שלם, שלא נפגע ו&quot; זנב &quot;המורכב מקטעי דנ&quot;א פגומים 3. דנ&quot;א פגום ניתן לתיקון על ידי מנגנונים שונים בגוף 4, אשר לשמור את הדור של הפסקות DNA מאוזנות למדי 5. אם, לעומת זאת, המאזן הוא לטובת הפסקות DNA, ההפסקות יכולות לצבור וסופו של דבר לתרום להתפתחות של מחלה. ה- DNA שלנו סובל כ 0.000165 נזק% בזמן נתון 6. הפסקות DNA חד גדילים מתייחסות לפגם באחד משני הגדילים של הסליל הכפול ה- DNAואילו הפסקות פעמיים גדילי דנ&quot;א נגרמות כאשר שני הגדילים של הסליל הכפול DNA פגומים. ישנם גורמים שונים אשר עשוי לשפר את כמות הפסקות DNA בכל זמן נתון, כגון גיל של התא, עשן סיגריות, תרופות שונות או סטרס חמצונים 7-9. אם כל הגורמים שהובילו להפסקות DNA משופרות נשמרים קבועים, אז כימות של הפסקות DNA באמצעות assay השביט היא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. השיטה של ​​assay השביט משמשת יותר ויותר היום ברפואה, כולל רפואת עיניים. אחת סיבות לכך היא שעקה חמצונית היא יותר ויותר מוכר כמנגנון pathogenetic למחלות שונות 8-11 וassay השביט הוא אחת שיטות שבי חמצוני לחץ עקיף ניתן לכמת.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials required for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor and Tips</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

אורגניזמים אוקריוטים גבוהים לא יכול לחיות ללא חמצן; עדיין, באופן פרדוקסלי, חמצן יכול להזיק להם. מולקולת החמצן כימית אדישה יחסית כי יש לו שני אלקטרונים מזווגים ממוקמים באורביטלים אנטי-מליטה * pi שונים. יש שני אלקטרונים אלה ספינים מקבילים, כלומר הם לסובב באותו הכיוון על הצירים שלהם. זו הסיבה שמולקולת החמצן היא לא מאוד תגובתי. הפעלה של חמצן עלולה להתרחש על ידי שני מנגנונים שונים; בין אם באמצעות הפחתה באמצעות אלקטרון אחד בכל פעם (הפחתה חד ערכי), או באמצעות קליטת אנרגיה מספיקה כדי להפוך את הספין של אחד האלקטרונים מזווגים. התוצאה היא הייצור של מינים תגובתי חמצוני (ROS). יש מספר דרכים שבה גוף האדם מבטל ROS במצב הפיזיולוגי שלה. אם ייצור ROS עולה על קיבולת התיקון, תוצאות סטרס חמצונים ונזקי מולקולות שונות. ישנן שיטות רבות ושונות שבי סטרס חמצונים יכולים להיות ליasured. כתב יד זה מתמקד באחת מהשיטות בשם ג&#39;ל אלקטרופורזה התא, המכונית גם &quot;assay שביט&quot; המאפשר מדידה של הפסקות DNA. אם כל הגורמים ידועים כגורמים לניזק לדנ&quot;א, מלבד סטרס חמצונים נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ&quot;א שנמדד על ידי assay שביט הוא פרמטר טוב של סטרס חמצונים. העיקרון הוא פשוט ומסתמך על העובדה שמולקולות ה- DNA טעונות שלילית. יש מולקולת הדנ&quot;א שלמה גודל כה גדול שזה לא להעביר באלקטרופורזה. הפסקות DNA, עם זאת, אם תוצאה הנוכחית בשברי קטנים שנעים בשדה החשמלי כלפי האנודה. שברים קטנים יותר להעביר מהר יותר. כמו שיש לי שברים בגדלים שונים התוצאה הסופית של אלקטרופורזה היא לא קו ברור אלא רצף עם הצורה של כוכב שביט. המערכת מאפשרת כימות של &quot;השביט&quot; וכתוצאה מכך וכך של הפסקות DNA בתא.

למרות שהשיטה של ​​assay השביט הופכת תוצאות לשחזור, ניתן להשפיע עליו על ידי מגוון גורמים. גורם אחד כזה הוא אם לויקוציטים הם cryopreserved לפני תמוגה וג&#39;ל אלקטרופורזה-או אם צעד זה מבוצע על כדוריות דם לבנות מוכנים טרי. איור 2 מראה כי בקבוצה 2, שבו כדוריות דם לבנות היו cryopreserved לפני DNA תמוגה וג&#39;ל אלקטרופורזה ס&quot;ס הפסקות היו גבוהות יותר באופן משמעותי, מאשר בקבוצת 1 שבי -electrophoresis תמוגה וג&#39;ל נעשה בתאים מוכנים טרי. גם assay יכול לשמש כדי להעריך סטרס חמצונים מערכתיים בעקיפין. טבלה 1 מציגה את סטטיסטיקת תאורית לרגע זנב ורגע אוליב במעשנים ונבדקים בריאים. הנתונים מגלים כי עישון מחצית חפיסת סיגריות מדי יום יותר מ מכפיל הפסקות ssDNA בלויקוציטים מחזור 9. <img alt="איור 1 א" src= &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> איור 1. (א) מתאר את מיקרוסקופ שימוש במהלך ניתוח assay שביט. (ב) Δ מתאר &quot;שביט&quot; טיפוסי עם ראש וזנב (קטעי דנ&quot;א פגום קטנים יותר) בהירים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> 2. הפסקות ssDNA איור היו גבוהות יותר באופן משמעותי כאשר כדוריות דם לבנות היו cryopreserved (הקבוצה 2) מאשר כאשר כדוריות דם לבנות מוכנים טרי שמשו לפני תמוגה וג&#39;ל אלקטרופורזה-. <imgalt = &quot;טבלת 1&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; היו מעשנים 1. שולחן יותר מכפול מספר ssDNA שובר בהשוואה לגיל ומין מותאם שאינם מעשנים בריאים.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

assay שביט מודד הפסקות DNA, הנגרמות על ידי גורמים שונים. אם כל הגורמים (מלבד סטרס חמצונים) גורמים נזק לדנ&quot;א נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ&quot;א הוא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש assay שביט למדידה עקיפה של סטרס חמצונים.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K Views.  University of Basel.  assay שביט מודד הפסקות DNA, הנגרמות על ידי גורמים שונים. אם כל הגורמים (מלבד סטרס חמצונים) גורמים נזק לדנ"א נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ"א הוא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש assay שביט למדידה עקיפה של סטרס חמצ...

Video: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Cancer Research

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Bioengineering

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genetics

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Neuroscience

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

To begin, prepare 0.6% low melting point agarose in PBS, and place it in a water bath at 37 degrees Celsius. Labeled the frosted end of the pre-coated slides with name, date, and treatment information using a permanent marker or pencil.
Place a chilling plate on a flat bench, and insert two frozen cooling packs into the sliding drawer below the metal surface. Then, place the slides on the chilling plate to pre-chill for 1 to 2 minutes. Centrifuge and remove the supernatant from the sample tubes, and place them immediately back on ice. Resuspend the cell pellet with 200 microliters of 0.6% low melting point agarose, and mix by pipetting.
Next, add 80 microliters of agarose-containing cells onto a chilled slide, and quickly place a coverslip on the gel. Allow the gel to set on the chilling plate for 1 to 2 minutes. In the meantime, prepare 500 milliliters of working solution of lysis buffer, and pour it into the lysis dish.
After the gels have set, remove the coverslips quickly by gently holding the slide between thumb and forefinger, and sliding the coverslip off the gel. Then, place the slides inside a slide carrier, with all the black dot marks on the slides facing in the same direction. Place the slide carrier inside the lysis dish. Close the lid of the lysis dish, and put it for incubation.
Carefully remove the slide carrier from the lysis dish without disturbing the gels. Gently, place the slide carrier in a washing dish pre-loaded with ice-cold double-distilled water. Ensure that the slides are completely submerged, and leave the setup for 30 minutes.
Place a frozen cooling pack under the electrophoresis tank to maintain optimal buffer temperature. Then, add ice-cold electrophoresis working solution to the tank, and transfer the slide carrier into it. Orient the slides, such that the cell containing gels point toward the cathode.
Incubate the slides in the electrophoresis tank for 20 minutes, to allow the DNA to unwind. Then, turn on the power supply to perform electrophoresis for 20 minutes at 1.19 volts per centimeter. After the electrophoresis is complete, turn off the power supply, and remove the slide carrier from the electrophoresis tank. Allow the slide carrier to drain on tissue paper for 30 seconds.
Next, place the slide carrier into a dish containing neutralization buffer, and leave it for 20 minutes. Following this, place it in a washing dish containing ice-cold double-distilled water, and leave it for 20 minutes. After washing, remove the slide carrier from the water, and allow the slides to dry in an incubator at 37 degrees Celsius for 1 hour.
To rehydrate the slides, transfer the slide carrier to a washing dish containing ice-cold double-distilled water and leave it for 30 minutes. Then, place the slide carrier into a staining dish containing 2.5 micrograms per milliliter propidium iodide solution.
Close the lid of the staining dish, and incubate it for 20 minutes in the dark at room temperature. After incubation, transfer the slide carrier to a separate dish, and wash it with ice-cold double-distilled water for 20 minutes.
Remove the slide carrier from the dish, and dry it completely in the dark, either in a 37 degrees Celsius incubator or at room temperature. After the slides dry completely, store them in a slide box in the dark until ready for image analysis.

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Cell-based assays

EoE Sub Articles

Thiobarbituric Acid-Reactive Substances Assay to Assess Oxidative Stress in Human Serum

Label the glass tubes for the samples to be analyzed, then, add 100 microliters of the prepared sample to each tube. Add 200 microliters of 8.1% SDS to each sample, and gently swirl the glass tube in a circular motion to mix.
Add 1.5 milliliters of 3.5 molar sodium acetate buffer to each sample. Then, add 1.5 milliliters of aqueous 0.8% thiobarbituric acid solution. Bring the final volume in each tube to 4 milliliters by adding 700 microliters of deionized water. Tightly cap the glass tubes, and incubate them in a heating block set to 95 degrees Celsius for 1 hour. Cover the tubes with aluminum foil to prevent condensation. Then, remove the tubes from the block and incubate them on ice for 30 minutes.
After the incubation, centrifuge the samples and standards at 1,500 x g for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Transfer 150 microliters of supernatant from each tube to a well in a 96-well plate, removing any air bubbles with a pipette tip.
Measure the absorbance of the samples at 532 nanometers. Then, subtract the average absorbance reading of the blank samples from all other absorbance readings.
Create a standard curve and use it to calculate unknown sample concentrations.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ"א בתאי Microarrayed אדם

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

Assaying ניזק לדנ"א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

יישום של

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ"א נזק חמצוני דנ"א עכברוש הכבד

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

בדיקת חומרים תגובתיים חומצה תיוברביטורית להערכת עקה חמצונית בסרום אנושי