אפיון חלבון מחייב RNA in vivo נשאר אתגר גדול בשל האופי המורכב של RNA ואת הגורמים הרבים המשפיעים על האינטראקציה שלה עם חלבונים. חלבון מחייב RNA או זיקה RBP-RNA נמדד בתוך תאים חיידקיים חיים. מאז הסביבה התאית משפיעה הן על המבנה של RNA והן על איגוד RBP-RNA וכתוצאה מכך, מדידת הזיקה ב- vivo חיונית להבנת אינטראקציות כאלה במערכות טבעיות.
סוד ההצלחה הוא בעיצוב הפלסמידים. העיצוב צריך להשתמש במספר גלים של דלתא ולהימנע החדרת קודונים להפסיק מוטציות מסגרות. התחל פרוטוקול זה על-ידי עיצוב קלטת אתר האיגוד.
כל גן מיני מכיל אתר הגבלת EagI, 40 בסיסים מחמשת הקצה העיקרי של גן ההתנגדות לקאנאמיצין, מקדם pLac/Ara, אתר כריכת הריבוזום, AUG של הגן mCherry, מרחב, אתר כריכת RBP, 80 בסיסים מחמשת החלקים הראשונים של הגן mCherry, ואתר הגבלת ApaLI. כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של ההתראה, תכנן שלוש קלטות אתר מחייבות עבור כל אתר איגוד עם רווחים המורכבים לפחות מבסיס אחד, שניים ושלושה בסיסים. לעכל פעמיים הן את הגנים מיני ואת וקטור היעד עם EagI HF ו ApaLI לפני ביצוע טיהור עמודה של העיכול.
Ligate הגנים מיני מתעכל עמוד השדרה של האתר מחייב המכיל את שאר הגן כתב mCherry, שליחות קטלנית ותנאם עמידות kanamycin. לאחר מכן להפוך את פתרון קשירה לתוך Escherichia coli העליון 10 תאים. לאחר זיהוי שנאים חיוביים באמצעות רצף סנגר, לאחסן פלסמידים מטוהרים בפורמט 96 גם במינוס 20 מעלות צלזיוס.
גם לאחסן את הזנים חיידקי כמו מניות גליצרול בפורמט 96 גם במינוס 80 מעלות צלזיוס. סדר מותאם אישית את רצף RBP הנדרש חסר קודון עצירה כגן מיני DNA כפול תקוע עם אתרי הגבלה בקצוות. הפוך את הפלסמידים המוכנים לתאי חיידקים מוכשרים מבחינה כימית שכבר מכילים פלסמיד RBP mCerulean.
כדי לחסוך זמן, צלחת התאים באמצעות צינור שמונה ערוצים על שמונה לוחות נתיב המכילים לוריא-ברתאני אגר עם אנטיביוטיקה רלוונטית. מושבות אמורות להופיע בעוד 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בחר מושבה אחת עבור כל טרנספורמנט כפול ולהעביר 48 צלחות באר המכיל 1.5 מיליליטר של LB עם אנטיביוטיקה מתאימה.
לגדל את התאים על פני תקופה של 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 250 סל"ד. לאחסן את הלילה כמו מניות גליצרול במינוס 80 מעלות צלזיוס ב 96 צלחות באר. בבוקר, לתכנת את הרובוט לחמם 180 microliters של בינוני חצי נקבוביות או SPM ב 96 צלחות גם.
תכנת את הרובוט להכין את צלחת התמריצים. בצלחת נקייה של 96 בארות, הכינו בארות עם SPM המורכב מ-95% BA ו-5%LB. מספר בארות מתאים למספר הרצוי של ריכוזי inducer.
הוסף C4-HSL ל בארות בצלחת inducer שיכיל את ריכוז inducer הגבוה ביותר. לאחר מכן, לתכנת את הרובוט כדי לדלל באופן סדרתי בינוני מכל בארות הריכוז הגבוה ביותר לתוך 23 ריכוזים נמוכים יותר החל אפס עד 218 nanomolar. הנפח של כל דילול מעורר צריך להיות מספיק עבור כל הזנים.
כדי לדלל את זנים לילה, לתכנת את הרובוט לדלל על ידי גורם של 10 על ידי ערבוב 20 microliters של חיידקים עם 180 microliters של SPM ב 48 צלחות היטב. ואז לדלל שוב על ידי גורם של 10 על ידי לקיחת 20 microliters מהתספורת מדולל לתוך צלחת המתח מוכן מראש מתאים למדידת פלואורסצנט. עכשיו לתכנת את הרובוט להוסיף את inducer מדולל מן צלחת inducer כדי 96 צלחות גם עם זנים מדוללים על פי הריכוזים הסופיים.
לנער את 96 צלחות באר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. במהלך תקופה זו, לקחת מדידות של צפיפות אופטית או OD ב 595 ננומטר, כמו גם mCherry ו mCerulean פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחת כל 30 דקות. למטרות נורמליזציה, למדוד צמיחה של SPM ללא תאים שנוספו.
מוצגות כאן עלילות תלת מימדיות למתח חיובי. העלילות מתארות רמות OD גולמיות, פלואורסצנטיות אקרולית ו פלואורסצנטיות mCherry כפונקציה של זמן וריכוז מעורר. רמות ביטוי מצב יציב mCerulean חושבו עבור כל ריכוז inducer עבור זנים חיוביים ושליליים.
קצב הייצור של mCherry חושב גם עבור כל ריכוז גורם עבור זנים חיוביים ושליליים. m אחוזי ייצור התווה כפונקציה של פלואורסצנטיות mCerulean ממוצע מעל שני כפילויות ביולוגיות עבור שני זנים. ההתאמה KRBP באמצעות הנוסחה המתאימה מוצגת עבור המתח החיובי המציג תגובת איגוד ספציפית.
עבור הזן השלילי, לא מופק ערך KRBP. עקומות תגובה מינון מנורמל נקבעו עבור 30 זנים שונים המבוססים על שני RBPs כמו 10 אתרי איגוד במקומות שונים. שלושה סוגים של תגובות נצפו, זיקה גבוהה, זיקה נמוכה, ואין זיקה.
מוצגות כאן תוצאות KRBP כמותיות עבור שני RBPs, חלבון מעיל MS2 וחלבון מעיל PP7 עם 10 קלטות אתר מחייבות שונות. עקומות תגובה מינון עבור חלבון מעיל MS2 עם אתר מחייב מוטציה בארבעה מקומות שונים מוצגים כאן כדי להדגים את ההשפעה של ריווח מוטנטים על ייצור mCherry. הרצף של אתר האיגוד שעבר מוטציה שנבדק מוצג.
חשוב להשתמש בטכניקה מבנית כגון צורה המבקשים לחקור כימית את המבנה של קומפלקס החלבון-RNA ולהמחיש אילו אזורי mRNA מושפעים מחייב RNA. לאחרונה, השתמשנו בטכניקה זו באופן תפוקה גבוהה כדי למדוד בו זמנית את הזיקה של RBPs ל 10, 000 אתרי איגוד.
