La caratterizzazione del legame proteico con l'RNA in vivo rimane una sfida importante a causa della natura complessa dell'RNA e dei molti fattori che influenzano la sua interazione con le proteine. La proteina legante l'RNA o affinità RBP-RNA viene misurata all'interno di cellule batteriche vive. Poiché l'ambiente cellulare influisce sia sulla struttura dell'RNA che sul risultante legame RBP-RNA, misurare l'affinità in vivo è fondamentale per comprendere tali interazioni nei sistemi naturali.
Il segreto del successo è nella progettazione dei plasmidi. Il progetto dovrebbe utilizzare diverse ondate di delta ed evitare l'inserimento di codoni stop e mutazioni frameshift. Iniziare questo protocollo progettando la cassetta del sito di associazione.
Ogni mini gene contiene un sito di restrizione EagI, 40 basi dalle cinque estremità prime del gene di resistenza alla kanamicina, il promotore pLac/Ara, il sito di legame ribosoma, AUG del gene mCherry, un distanziale, un sito di legame RBP, 80 basi dalle cinque estremità principali del gene mCherry e un sito di restrizione ApaLI. Per aumentare il tasso di successo del saggio, progettare tre cassette del sito di rilegatura per ogni sito di rilegatura con distanziale composto da almeno una, due e tre basi. Digerisci due volte sia i mini geni che il vettore bersaglio con EagI HF e ApaLI prima di eseguire la purificazione delle colonne dei digest.
Legare i mini geni digeriti alla spina dorsale del sito di legame contenente il resto del gene reporter mCherry, terminatore e un gene di resistenza alla kanamicina. Quindi trasformare la soluzione di lissgation in Escherichia coli top 10 cellule. Dopo aver identificato i trasformatori positivi tramite sequenziamento Sanger, conservare i plasmidi purificati nel formato del pozzo 96 a meno 20 gradi Celsius.
Conservare anche i ceppi batterici come scorte di glicerolo nel formato 96 bene a meno 80 gradi Celsius. Ordina in modo personalizzato la sequenza RBP richiesta priva di un codone di arresto come mini gene del DNA a doppio filamento con siti di restrizione alle estremità. Trasformare i plasmidi preparati in cellule batteriche chimicamente competenti contenenti già un plasmide RBP mCerulean.
Per risparmiare tempo, placcare le cellule utilizzando una pipetter a otto canali su lastre a otto corsie contenenti agar Luria-Bertani con antibiotici pertinenti. Le colonie dovrebbero apparire in 16 ore a 37 gradi Celsius. Selezionare una singola colonia per ogni doppio trasformatore e trasferirli in 48 piastre di pozzo contenenti 1,5 millilitri di LB con antibiotici appropriati.
Far crescere le cellule per un periodo di 18 ore a 37 gradi Celsius tremando a 250 giri/min. Conservare le pernottamenti come scorte di glicerolo a meno 80 gradi Celsius in 96 piastre di pozzo. Al mattino, programmare il robot per riscaldare 180 microlitri di mezzo semi-poro o SPM in 96 piastre di pozzo.
Programmare il robot per preparare la piastra dell'induttore. In una piastra pulita da 96 pozza, preparare pozzali con SPM composto da 95%BA e 5%LB. Il numero di pozzi corrisponde al numero desiderato di concentrazioni di induttori.
Aggiungere C4-HSL ai pozzi nella piastra dell'induttore che conterrà la più alta concentrazione di induttori. Successivamente, programmare il robot per diluire serialmente il mezzo da ciascuno dei pozzi di concentrazione più alti in 23 concentrazioni inferiori che vanno da zero a 218 nanomolari. Il volume di ogni diluizione dell'induttore dovrebbe essere sufficiente per tutti i ceppi.
Per diluire i ceppi notturni, programmare il robot per diluire di un fattore 10 mescolando 20 microlitri di batteri con 180 microlitri di SPM in 48 piastre di pozzo. Quindi diluire di nuovo di un fattore 10 prendendo 20 microlitri dalla soluzione diluita nella piastra di deformazione pre-preparata adatta per la misurazione fluorescente. Ora programma il robot per aggiungere l'induttore diluito dalla piastra dell'induttore alle piastre del pozzo 96 con i ceppi diluiti in base alle concentrazioni finali.
Agitare i 96 piatti bene a 37 gradi Celsius per sei ore. Durante questo periodo, prendere le misurazioni della densità ottica o dell'OD a 595 nanometri, nonché della fluorescenza mCherry e mCerulean tramite un lettore di piastre ogni 30 minuti. Ai fini della normalizzazione, misurare la crescita di SPM senza l'aggiunta di celle.
Qui sono mostrati grafici tridimensionali per un ceppo positivo. Le trame raffigurano livelli di OD grezzi, fluorescenza mCerulea e fluorescenza mCherry in funzione della concentrazione di tempo e induttori. I livelli di espressione dello stato stazionario mCeruleano sono stati calcolati per ogni concentrazione di induttori sia per i ceppi positivi che per i ceppi negativi.
Il tasso di produzione di mCherry è stato calcolato anche per ogni concentrazione di induttori sia per i ceppi positivi che per i ceppi negativi. Il tasso di produzione di mCherry è stato tracciato in funzione della fluorescenza mCerulea media su due duplicati biologici per due ceppi. Il KRBP di adattamento utilizzando la formula di raccordo viene mostrato per lo sforzo positivo che presenta una risposta di attacco specifica.
Per il ceppo negativo, non è stato estratto alcun valore KRBP. Le curve di risposta alla dose normalizzate sono state determinate per 30 ceppi diversi basati su due RMP come 10 siti di legame in luoghi diversi. Vengono osservati tre tipi di risposte, alta affinità, bassa affinità e nessuna affinità.
Di seguito sono riportati i risultati quantitativi del KRBP per due RRP, la proteina del mantello MS2 e la proteina del mantello PP7 con 10 diverse cassette del sito di rilegatura. Le curve di risposta alla dose per la proteina del mantello MS2 con un sito di legame mutante in quattro luoghi diversi sono mostrate qui per dimostrare l'effetto della spaziatura mutante sulla produzione di mCherry. Viene visualizzata la sequenza del sito di associazione mutato testato.
È importante utilizzare una tecnica strutturale come la forma cercare di sondare chimicamente la struttura del complesso proteina-RNA e visualizzare quali regioni di mRNA sono influenzate dal legame dell'RNA. Di recente, questa tecnica è stata utilizzata in modo ad alta velocità effettiva per misurare contemporaneamente l'affinità degli RMP in 10.000 siti di associazione.
